梨火疫病菌中未配對(duì)的luxR同源基因的功能初析以及ExpR蛋白的原核表達(dá)及純化.pdf

1、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)能夠引起仁果類果樹(shù)及一些薔薇科植物的火疫病害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是一類具有毀滅性危害的細(xì)菌性病害。目前，人們已經(jīng)對(duì)梨火疫病菌的致病機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研究，為進(jìn)一步有效防治火疫病打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 細(xì)菌是社會(huì)生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的微生物，可以與相鄰細(xì)菌彼此聯(lián)系。細(xì)菌根據(jù)特定信號(hào)分子的濃度可以監(jiān)測(cè)周圍環(huán)境中自身或其它細(xì)菌的數(shù)量變化，當(dāng)信號(hào)達(dá)到一定的濃度閩值時(shí)，能啟動(dòng)菌體中相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)適

2、應(yīng)環(huán)境中的變化，這一調(diào)控系統(tǒng)被稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing)。群體感應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的依靠細(xì)胞密度控制毒力，胞外酶合成，運(yùn)動(dòng)，營(yíng)養(yǎng)攝入，及生物膜形成的調(diào)控系統(tǒng)。QS代表了革蘭氏陰性菌調(diào)節(jié)基因的主要模式表達(dá)。
　　 LuxR家族轉(zhuǎn)錄因子是一類分布廣泛和功能多樣的調(diào)控因子，屬于四環(huán)素蛋白家族。它可以激活和抑制許多基因的表達(dá)，包括調(diào)控相鄰基因和自我調(diào)控，從而涉及許多重要的生理活動(dòng)，如致病因子的產(chǎn)生，生物膜的形成，群

3、體感應(yīng)(QS)，乙酸代謝，運(yùn)動(dòng)，發(fā)光，生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)等。我們總結(jié)了LuxR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的相關(guān)機(jī)制和多樣性的功能，它們結(jié)合特異性DNA蛋白序列，通過(guò)增強(qiáng)或衰減，以確保靶基因的準(zhǔn)確表達(dá)。luxR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是廣泛分布于革蘭氏陰性細(xì)菌的四環(huán)素蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子成員，含有一個(gè)螺旋的HTHC-末端的DNA結(jié)合域。
　　 本研究首次鑒定并克隆出了梨火疫病菌的未配對(duì)的luxR同源基因EaluxR。利用插入突變的方法，獲得luxR的突變體Ea△l

4、uxR及其互補(bǔ)子Ea△luxR(pBBRRH)，進(jìn)而初步研究了該基因?qū)σ恍┥飳W(xué)特性的影響。研究結(jié)果表明，與野生型病菌的強(qiáng)致病力相比，luxR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的突變株對(duì)于梨葉及梨幼果的的致病性明顯減弱，在NA液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度明顯減慢，對(duì)耐過(guò)氧化氫及胞外多糖產(chǎn)生能力明顯減弱，但是，對(duì)煙草過(guò)敏性反應(yīng)，抗生素耐性，生物膜形成沒(méi)有任何影響。
　　 群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)就是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度的變化而進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)

5、控的生理行為。革蘭氏陰性茵的群體感應(yīng)系統(tǒng)主要受LuxI-LuxR型蛋白的調(diào)控。其中，LuxR蛋白在作為信號(hào)分子的受體蛋白的同時(shí)，還能激活一系列相關(guān)基因的表達(dá)。本研究在本實(shí)驗(yàn)室已有的研究工作的基礎(chǔ)上，采用PCR法擴(kuò)增了EaexpR基因編碼區(qū)，經(jīng)酶切鑒定、序列分析后，將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a中，得到重組質(zhì)粒pET28a22801。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosepta(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞并經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(I