稻飛虱與其體內(nèi)寄生菌Wolbachia和Cardinium的分子進(jìn)化關(guān)系研究.pdf

1、稻飛虱（半翅目:飛虱科）是我國(guó)和其他許多亞洲國(guó)家當(dāng)前水稻上的重要害蟲(chóng)。其中最為重要的三種稻飛虱優(yōu)勢(shì)種是褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱。除了直接刺吸危害水稻以外，它們還能傳播病毒病害，對(duì)水稻的產(chǎn)量造成嚴(yán)重的損失。由于其短時(shí)間內(nèi)即可暴發(fā)成災(zāi)的特性，當(dāng)前對(duì)稻飛虱的防治方法仍然以傳統(tǒng)的化學(xué)防治為主。長(zhǎng)期的農(nóng)藥使用不僅造成了稻飛虱的抗藥性問(wèn)題，也引起了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。因此，尋找更為有效且環(huán)境友好的治理稻飛虱問(wèn)題的方法就顯得尤為重要。胞內(nèi)共生菌

2、Wolbachia和Cardinium作為一類(lèi)生防因子，有著很好的生防應(yīng)用潛力。
　　本文通過(guò)系統(tǒng)的調(diào)查，揭示了Wolbachia和Cardinium在褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱自然種群中的感染情況?；诙辔稽c(diǎn)序列分型技術(shù)和基因重組分析，明確地鑒定了這三種稻飛虱及其相關(guān)物種中感染的Wolbachia株系類(lèi)型，揭示了它們之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和遺傳變異的方式，并探討了稻飛虱中這兩類(lèi)寄生菌的來(lái)源。通過(guò)對(duì)三種飛虱線(xiàn)粒體基因組的研究，深入分析了

3、胞內(nèi)共生菌Wolbachia與稻飛虱之間的進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)對(duì)稻飛虱中誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和(cytoplasmicincompatibility，CI)的wStri株系和不誘導(dǎo)CI作用的wLug株系的基因組測(cè)序，深入地比較了已有Wolbachia基因組之間的差異性。這些研究工作為進(jìn)一步揭示誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理和利用胞內(nèi)共生菌治理稻飛虱的研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。
　　1.Wolbachia和Cardinium在中國(guó)稻飛虱優(yōu)勢(shì)種中的感染情

4、況
　　研究結(jié)果表明，分布于全國(guó)各個(gè)稻區(qū)的三種主要稻飛虱對(duì)Wolbachia和Cardinium的感染情況有著明顯的差異。其中灰飛虱的感染率最高（幾乎為100％），其次為白背飛虱，褐飛虱的感染率最低。在檢測(cè)的15個(gè)灰飛虱地理種群中，有14個(gè)種群都是100％感染，只有一個(gè)西北種群（甘肅靖遠(yuǎn)）種群完全不感染W(wǎng)olbachia。對(duì)于白背飛虱，雌雄蟲(chóng)中Wolbachia的感染情況有著明顯的差別。雌蟲(chóng)幾乎都是100％感染，而各個(gè)種群中的雄蟲(chóng)

5、感染率卻不盡相同，從22.2％～95.0％不等。進(jìn)一步對(duì)Wolbachia宿主特異性WO噬菌體的檢測(cè)結(jié)果表明，自然種群雄蟲(chóng)中Wolbachia的感染率與在不感染個(gè)體中檢測(cè)到的WO噬菌體的比率呈明顯的負(fù)相關(guān)。因此推測(cè)，雄蟲(chóng)中Wolbachia感染率相對(duì)較低的原因可能是由于Wolbachia基因組中溶原性的WO噬菌體受到某種因素的誘導(dǎo)已轉(zhuǎn)化為裂解性噬菌體，并且這種誘發(fā)機(jī)制與寄主的性別存在著一定的相關(guān)性。對(duì)于另一類(lèi)胞內(nèi)寄生菌Cardinium

6、，在三種稻飛虱中只有白背飛虱雙重感染了Wolbachia和Cardinium，并且白背飛虱各種群Cardinium的感染率幾乎均為100％。對(duì)飛白背虱的不同組織部位檢測(cè)結(jié)果表明，與褐飛虱、灰飛虱相似，Wolbachia和Cardinium這兩類(lèi)胞內(nèi)共生菌不僅在白背飛虱的生殖組織中感染，在非生殖組織（頭部、胸部、足和翅）中同樣感染。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示W(wǎng)olbachia和Cardinium雙重感染條件下對(duì)寄主的生殖調(diào)控作用及其機(jī)制、垂直傳

7、播規(guī)律、兩者之間的相互關(guān)系以及進(jìn)一步的應(yīng)用研究等方面提供了重要的理論基礎(chǔ)。
　　2.Wolbachia的系統(tǒng)發(fā)育研究和稻飛虱中胞內(nèi)共生菌的來(lái)源推測(cè)
　　運(yùn)用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MultilocusSequenceTyping，MLST）對(duì)不同寄主中的Wolbachia株系鑒定結(jié)果表明，灰飛虱與白背飛虱感染了同一個(gè)Wolbachia株系（wStri）;褐飛虱感染了另一個(gè)Wolbachia株系(wLug)且與其近緣種偽褐飛虱中發(fā)

8、現(xiàn)的Wolbachia株系（命名為wMui）的親緣關(guān)系并不是最近緣的。這些Wolbachia株系與寄主之間沒(méi)有明顯的共進(jìn)化現(xiàn)象。另外，在一種葉蟬中也檢測(cè)到了三種Wolbachia株系（不確定其真實(shí)寄主，暫命名為wMfasl、wMfas2、wMfas3）。限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）實(shí)驗(yàn)和直接測(cè)序結(jié)果表明，與灰飛虱、白背飛虱一樣，在褐飛虱自然種群個(gè)體中同樣存在感染了Wolbachia的內(nèi)寄生物。經(jīng)MLST驗(yàn)證表明，這些可能源自于稻

9、飛虱內(nèi)寄生物的Wolbachia株系中，除了wWasp株系以外，還發(fā)現(xiàn)有wStri株系。稻飛虱與其寄生物感染相同株系的Wolbachia和Cardinium，表明了三種飛虱中這兩類(lèi)寄生菌很可能都是通過(guò)水平傳播獲得的。同源基因重組檢測(cè)結(jié)果表明，不同Wolbachia株系之間存在著基因重組現(xiàn)象，并且在飛虱感染的Wolbachia株系與稻田生態(tài)系統(tǒng)中與飛虱有一定相關(guān)性的其他物種中感染的Wolbachia之間存在著廣泛的wsp基因重組現(xiàn)象。這些

10、研究結(jié)果有助于我們理解稻飛虱中Wolbachia的遺傳變異方式。
　　3.稻飛虱中Wolbachia的人工轉(zhuǎn)染研究初探
　　前期的研究結(jié)果表明，褐飛虱體內(nèi)感染的Wolbachia株系不能誘導(dǎo)寄主的細(xì)胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，而灰飛虱和白背飛虱中感染的Wolbachia能誘導(dǎo)較強(qiáng)的CI作用。并且前文的研究結(jié)果表明，自然種群中褐飛虱、灰飛虱感染的Wolbachia之間似乎并不能相互水平傳染。這是因?yàn)闆](méi)有水平傳播的媒介？還是由于寄主本身的遺

11、傳差異性引起的？為了揭示不同Wolbachia株系與稻飛虱的相互關(guān)系以及探索Wolbachia等胞內(nèi)共生菌在稻飛虱生防應(yīng)用中的潛力，本文以不感染的稻飛虱為研究材料，采用顯微注射的方法對(duì)不同稻飛虱進(jìn)行了不同Wolbachia株系的人工轉(zhuǎn)染研究。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，褐飛虱、灰飛虱中感染的Wolbachia株系在這兩種飛虱之間相互轉(zhuǎn)染較難實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步將煙粉虱以及葉螨中感染的Wolbachia株系注射到褐飛虱中的研究表明，這些物種中的Wo

12、lbachia株系也不能在褐飛虱中成功的定殖。這些研究結(jié)果表明，褐飛虱、灰飛虱中感染的Wolbachia株系在兩種飛虱間不能相互轉(zhuǎn)染的主要原因可能并不是沒(méi)有合適的水平傳播媒介，而是更多的與兩種飛虱的遺傳背景差異有關(guān)，很可能是跟寄主的免疫有關(guān)。
　　4.胞內(nèi)共生菌與三種稻飛虱的進(jìn)化關(guān)系研究
　　以三種飛虱的線(xiàn)粒體基因組以及灰飛虱線(xiàn)粒體多樣性研究做為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討了稻飛虱與其胞內(nèi)共生菌之間的進(jìn)化關(guān)系。研究結(jié)果表明:1.三種稻

13、飛虱的線(xiàn)粒體基因組有著許多共同的特征，比如:線(xiàn)粒體基因的重排方式、控制區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性（含有可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列VNTRs，variablenumberoftandemrepeats）、不正常的atp8基因長(zhǎng)度等。這些特征表明了三種飛虱有著共同的祖先特征。2.三種飛虱中，灰飛虱與白背飛虱之間相對(duì)更近的進(jìn)化關(guān)系也有著許多線(xiàn)粒體基因組特征的支撐，比如:兩者線(xiàn)粒體控制區(qū)中的重復(fù)區(qū)有著完全一樣的重復(fù)單元（且與褐飛虱中的重復(fù)單元序列相似），蛋白編碼基

14、因有著更為相似的基因長(zhǎng)度，trnS2有著類(lèi)似的二級(jí)結(jié)構(gòu)等等。3.利用線(xiàn)粒體基因組蛋白編碼基因同義替換率推測(cè):白背飛虱與灰飛虱大概是在80.3～87.6百萬(wàn)年前發(fā)生的分化;褐飛虱的分化更早一點(diǎn)，大概發(fā)生在87.3～95.2百萬(wàn)年前。而wStri與wLug兩個(gè)株系之間的分化時(shí)間大約在12.4-14.1百萬(wàn)年左右。通過(guò)物種分化形成時(shí)間的對(duì)比，揭示了三種稻飛虱中感染的Wolbachia是在稻飛虱進(jìn)化后期通過(guò)感染獲得的，而不是早先存在于三種飛虱的

15、祖先種中并隨之進(jìn)化而來(lái)的。4.有研究表明，灰飛虱感染的Wolbachia株系wStri對(duì)寄主有著極強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和的能力。因此，wStri自侵染灰飛虱后理論上會(huì)導(dǎo)致灰飛虱線(xiàn)粒體多樣性的降低?；绎w虱線(xiàn)粒體單倍型的研究表明，雖然灰飛虱自然種群個(gè)體間的分化程度較?。ㄐ蛄袉伪缎椭g的差異小于1％），但是單倍型之間仍然存在的一定程度的分化。這說(shuō)明了灰飛虱中wStri株系的感染已經(jīng)有了一定的歷史時(shí)間。對(duì)比白背飛虱自然個(gè)體線(xiàn)粒體的分化程度，本研究

16、認(rèn)為雖然稻飛虱感染W(wǎng)olbachia在稻飛虱物種進(jìn)化過(guò)程中的歷史相對(duì)較短，但是在兩種飛虱中Wolbachia的感染時(shí)間可能仍存在差異性（wStri株系感染灰飛虱的歷史可能要比感染白背飛虱的歷史更久遠(yuǎn)一些）。
　　5.稻飛虱中Wolbachia的比較基因組學(xué)研究
　　Wolbachia對(duì)寄主的生殖調(diào)控機(jī)理一直以來(lái)都是胞內(nèi)共生菌研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。三種飛虱中感染的兩個(gè)Wolbachia株系一個(gè)誘導(dǎo)CI（灰飛虱和白背感染的wStri

17、株系）作用，另外一個(gè)不誘導(dǎo)CI（褐飛虱感染的wLug株系），系統(tǒng)發(fā)育研究表明這兩者的親緣關(guān)系又比較近，因此是研究Wolbachia誘導(dǎo)CI分子機(jī)理很好的比較基因組學(xué)研究材料。同時(shí)，現(xiàn)有的已完成基因組測(cè)序的Wolbachia株系中還沒(méi)有不誘導(dǎo)CI的Wolbachia株系，開(kāi)展本研究中兩種不同生殖調(diào)控表型的Wolbachia基因組學(xué)的研究有利于我們更進(jìn)一步的揭示W(wǎng)olbachia誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理。以這兩個(gè)Wolbachia株系的全基因組測(cè)

18、序?yàn)檠芯壳腥朦c(diǎn)，本文從比較基因組學(xué)的角度對(duì)誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理做了初步的探索研究。研究結(jié)果表明:本文中所測(cè)的兩個(gè)Wolbachia株系是目前研究發(fā)現(xiàn)最大的Wolbachia基因組，分別含有1771(wStri)和1589(wLug)個(gè)基因，并且都包含了四型分泌系統(tǒng)（ThetypeⅣsecretionsystem，T4SS）相關(guān)的基因。2.通過(guò)與已知Wolbachia株系基因組的比較，揭示了不同Wolbachia大組之間的差異性。3.兩個(gè)W