光皮樺組織快繁及轉(zhuǎn)基因體系建立.pdf

1、本文系統(tǒng)地研究了光皮樺組織培養(yǎng)快速繁殖與轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。分別以莖段和葉片為試驗(yàn)外植體材料,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和完全組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),建立并優(yōu)化了光皮樺組織培養(yǎng)快速繁殖體系。在此基礎(chǔ)之上,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),以光皮樺組培苗葉片為受體材料,通過(guò)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)染色確定遺傳轉(zhuǎn)化率,研究了不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、AS濃度、浸染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間5個(gè)因素在4個(gè)水平上對(duì)光皮樺遺傳轉(zhuǎn)化的影響,并研究探討光皮樺轉(zhuǎn)化中添加羧芐青霉素與卡那霉素的適宜濃度,初步建

2、立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效光皮樺遺傳轉(zhuǎn)化體系。該試驗(yàn)結(jié)果為光皮樺的優(yōu)良品種快繁建立了技術(shù)平臺(tái),同時(shí)為光皮樺遺傳轉(zhuǎn)化體系建立提供了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 高效且穩(wěn)定的組培快繁體系的建立是獲得高頻的遺傳轉(zhuǎn)化效率的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以光皮樺莖段、葉片為外植體,系統(tǒng)地研究了不同基本培養(yǎng)基、不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)誘導(dǎo)芽分化及再生苗生根的影響,采用“一步成芽”的方法（莖段、葉片直接產(chǎn)生叢生芽）,無(wú)需芽增殖階段,平均芽數(shù)可達(dá)到5.43個(gè)和12個(gè),分

3、化率為99.85％和80％,大大提高了試驗(yàn)效率;建立及優(yōu)化光皮樺的組培快繁體系、建立了光皮樺遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　 1.光皮樺莖段、葉片在MS培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)的不定芽最多,且芽生長(zhǎng)狀況良好,顏色深綠;故選擇MS基本培養(yǎng)基為光皮樺高效再生的最佳基本培養(yǎng)基。
　　 2.本次試驗(yàn)中,以光皮樺莖段為外植體,對(duì)不定芽誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基中添加,TDZ、6-BA和TDZ、6-BA與NAA兩種不組合激素組合進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明,光皮樺莖段在誘導(dǎo)

4、芽分化階段,只添加細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ,能促進(jìn)誘導(dǎo)芽分化,生長(zhǎng)素NAA對(duì)芽分化率無(wú)顯著影響。
　　 3.光皮樺以莖段為外植體的最佳不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS+0.50mg·L-16-BA+0.10mg·L-1TDZ+30mg·L-1蔗糖+5.50g·L-1瓊脂,在該培養(yǎng)基上叢生芽分化率高達(dá)99.85％,平均誘導(dǎo)芽數(shù)為5.43個(gè)。
　　 4.光皮樺以葉片為外植體的最佳不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)為MS+TDZ1.0mg·L-1

5、+NAA0.05mg·L-1+蔗糖30g·L-1+瓊脂5.5g·L-1,在該培養(yǎng)基上葉片叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)到80.00％,平均不定芽數(shù)高達(dá)12個(gè),且芽生長(zhǎng)健壯,呈深綠色。
　　 5.在光皮樺再生苗生根階段,在以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的前提下,對(duì)激素IBA與NAA進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn),最終篩選出:激素IBA比NAA更適于光皮樺的生根培養(yǎng)。
　　 6.光皮樺最佳再生苗生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA1.0mg·L-1+蔗糖20g

6、·L-1+瓊脂5.5g·L-1,在該培養(yǎng)基上再生苗的生根率達(dá)100％,平均根數(shù)為14.5個(gè),平均根長(zhǎng)為10～11cm,根較粗壯,基部無(wú)愈傷組織,且產(chǎn)生了很多毛細(xì)根。
　　 7.光皮樺葉片的Hyg抗性比較敏感,在不含潮霉素的不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上不定芽分化率可達(dá)80％,且不定芽生長(zhǎng)狀況良好;而當(dāng)不定芽在含潮霉素20mg·L-1的不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上,則漸漸變黑死亡。因此本次試驗(yàn)選擇20mg·L-1Hyg作為光皮樺葉片遺傳轉(zhuǎn)化的H