銀杏內(nèi)生真菌Chaetomium globosum CDW7次生代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌分布廣泛，其次生代謝產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性，被認(rèn)為是生物活性物質(zhì)的重要資源。內(nèi)生菌在與宿主植物協(xié)同進(jìn)化過程中，能夠合成活性物質(zhì)協(xié)助宿主抵御外來病原物侵染或逆境脅迫。銀杏是現(xiàn)存的地球上最古老的樹種之一，具有很高的研究開發(fā)價值，在其生長期間很少感染病蟲害且壽命極長，從中極有可能發(fā)現(xiàn)具備良好活性的內(nèi)生菌株。因而，研究銀杏內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
　　本文以小麥赤霉病菌（Fusariumgr

2、aminearum）、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)為測試靶標(biāo)菌，采用瓊脂擴(kuò)散法從80株銀杏內(nèi)生真菌中篩選具有抗植物病原真菌活性的菌株。結(jié)果顯示，15株內(nèi)生菌株具有一定的抑制植物病原真菌活性，其中菌株CDW7對3種測試菌均具有較強(qiáng)的抑制活性。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定該菌株為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomiumglobosum）。菌株CDW7發(fā)酵

3、液對小麥赤霉病菌平板抑菌活性研究表明，稀釋3倍后的PD發(fā)酵液能完全抑制小麥赤霉病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā);溫室實(shí)驗(yàn)表明,PD發(fā)酵液對小麥赤霉病的保護(hù)和治療作用防效分別達(dá)54.9％和48.8％。采用活性追蹤快速分離方法，從CDW7發(fā)酵液二氯甲烷萃取物中分離獲得6個化合物(LB-1-LB-6)，包括5種球毛殼菌素和1種苯二醛衍生物黃柄曲菌素(flavipin，1，2-benzenedicarboxaldehyde-3，4，5-trihydro

4、xy-6-methyl，LB-6)。5種球毛殼菌素中，3種為已知化合物，分別為chaetoglobosinA(LB-3)、chaetoglobosinC(LB-5)和chaetoglobosinF(LB-2)，2種為新結(jié)構(gòu)化合物，分別命名為21-methoxy-chaetoglobosinF(LB-1)和chaetoglobosinY(LB-4)。抗菌活性測試顯示，化合物flavipin和chaetoglobosinA對多種植物病原真菌

5、具有較強(qiáng)的抑制活性。其中，flavipin對小麥赤霉病菌的EC50值為0.73μg/mL，與陽性對照多菌靈（0.5μg/mL）相當(dāng);化合物chaetoglobosinA對油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、辣椒疫霉病菌和番茄早疫病菌EC50均在1.0μg/mL以下。
　　本研究同時采用DPPH自由基清除法(DPPH)和鐵離子還原法(FRAP)，對80株銀杏內(nèi)生真菌代謝物抗氧化活性進(jìn)行篩選，得到7株代謝物具有抗氧化活性的菌株，分別鑒定為球毛

6、殼菌(ChaetomiumglobosumCDW7)、膠孢炭疽菌（ColletotrichumgloeosporioidesNJSC8）、裂褶菌（SchizophyllumcommuneNJSP73）、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.NJWP10)、白囊齒耙菌(IrpexlacteusNJWP72)、毛殼菌屬(Chaetomiumsp.TXCP41)和青霉屬(Penicilliumsp.TXP58)。其中，菌株CDW7代謝物具有較強(qiáng)

7、的抗氧化活性，DPPH法中IC50值為6.33μg/mL，F(xiàn)RAP法中C0.5FRAP值為30.78μg/mL，和陽性對照VitaminC相當(dāng)。利用活性指導(dǎo)分離，從菌株CDW7發(fā)酵液代謝物中得到化合物黃柄曲菌素(flavipin，LB-6)。體外(DPPH、ABTS、FRAP、ORAC、LPO)和體內(nèi)(SOD、GSH-Px、MDA)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，flavipin具有顯著的抗氧化能力，可作為新型抗氧化劑進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)。
　

8、　由于菌株CDW7能產(chǎn)生具有抗菌、抗氧化活性的次生代謝物flavipin。本研究以flavipin產(chǎn)量為指導(dǎo)，對該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件為25℃，100mL/250mL瓶，12菌餅/250mL瓶，150rpm，pH6.5，PD培養(yǎng)基發(fā)酵14天，flavipin產(chǎn)量達(dá)315.5mg/L。相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，flavipin產(chǎn)量和CDW7發(fā)酵液粗提物抗氧化活性呈正相關(guān)關(guān)系，決定系數(shù)為0.8235，表明化合物flavipin是菌