重要雙殼貝類細(xì)胞遺傳圖譜構(gòu)建及基因組特征分析.pdf

1、雙殼類在全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，多數(shù)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖貝類如扇貝、牡蠣都屬于雙殼綱。本研究針對(duì)重要雙殼類長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)開展了分子細(xì)胞遺傳學(xué)和基因組學(xué)的研究，為促進(jìn)基因資源發(fā)掘和良種選育奠定基礎(chǔ)。
　　1.長(zhǎng)牡蠣染色體鑒別及染色體圖譜構(gòu)建
　　本研究利用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH

2、)將18個(gè) BAC克隆及18S-28S rDNA分別定位在長(zhǎng)牡蠣的10條染色體上，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)牡蠣全部染色體的區(qū)分鑒定，構(gòu)建了染色體圖譜。依據(jù) FISH結(jié)果，將染色體從大到小排列，分別命名為1號(hào)到10號(hào)染色體。其中2個(gè)克隆需要使用Cot-1 DNA封阻后才能產(chǎn)生清晰的陽性信號(hào)。一個(gè)克隆定位在兩條染色體上，其余17個(gè)克隆有單一的染色體定位。染色體的準(zhǔn)確鑒別在長(zhǎng)牡蠣非整倍體鑒定、多倍體染色體丟失等研究中有重要作用。
　　定位的BAC克隆中

3、，8個(gè)克隆的全長(zhǎng)序列已測(cè)序獲得，與GenBank中長(zhǎng)牡蠣數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)，結(jié)果表明這8個(gè)克隆包含I型TGF-β受體、金屬硫蛋白等近50種基因；利用Tandem Repeats Finder(TFR)軟件在序列中查找到199個(gè)微衛(wèi)星，其中一個(gè)微衛(wèi)星已知位于4號(hào)連鎖群，根據(jù)FISH結(jié)果可以將4號(hào)連鎖群與6號(hào)染色體關(guān)聯(lián)。其余10個(gè)BAC克隆經(jīng)雙末端測(cè)序共獲得14條高質(zhì)量序列。將18個(gè)BAC克隆的序列與長(zhǎng)牡蠣基因組序列拼接版本oyster_

4、v9進(jìn)行BlastN比對(duì)，結(jié)果14個(gè)BAC克隆與30條scaffold關(guān)聯(lián)。
　　2.長(zhǎng)牡蠣染色體圖譜與遺傳連鎖圖譜的整合
　　從長(zhǎng)牡蠣10個(gè)遺傳連鎖群上挑選50個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，在BAC文庫(kù)中進(jìn)行PCR篩選，有33個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記得以成功篩選。22個(gè)克隆利用熒光原位雜交技術(shù)定位在10條染色體上，其中19個(gè)克隆的定位需要使用Cot-1 DNA進(jìn)行封阻。結(jié)合本研究開發(fā)的染色體特異性探針，將10個(gè)連鎖群分別與10條染色體整合，并確定了8

5、條連鎖群的方向，驗(yàn)證了遺傳圖譜中的標(biāo)記位置。將微衛(wèi)星序列與長(zhǎng)牡蠣基因組序列拼接版本oyster_v9 BlastN比對(duì)，19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均與一條scaffold關(guān)聯(lián)。這些微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳圖譜、染色體圖譜和基因組序列圖譜中的位置都已獲得，可作為錨定標(biāo)記實(shí)現(xiàn)各個(gè)圖譜的整合，對(duì)牡蠣基因組研究具有重要意義。
　　3.櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
　　本研究對(duì)櫛孔扇貝的胚胎、幼蟲及多個(gè)成體組織進(jìn)行了454轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，經(jīng)測(cè)序共獲得1

6、,033,636條高質(zhì)量序列，等級(jí)拼接共獲得26,165條contig，聚類獲得24,437條isotig，進(jìn)一步分組到20,056個(gè)isogroups。對(duì)序列進(jìn)行同源比對(duì)注釋后共9,328(47％ isogroups)條獲得注釋信息。對(duì)注釋序列進(jìn)行GO分類及 KEGG代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)了大量與生長(zhǎng)、生殖和壓力/免疫等相關(guān)的功能基因。與蝦夷扇貝的轉(zhuǎn)錄組比較，結(jié)果顯示兩種扇貝的GO注釋結(jié)構(gòu)類似。兩個(gè)物種序列互相比對(duì)獲得1,709個(gè)直系同源