?？菸〔≡?xì)菌的分離、鑒定及分子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、近年來(lái),浙江,廣東等桑樹主栽區(qū)相繼發(fā)生一種類似于桑青枯病的新型病害,對(duì)蠶桑業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。本研究通過(guò)對(duì)引發(fā)桑細(xì)菌性枯萎病病原的分離,鑒定和分子檢測(cè)進(jìn)行探討。為國(guó)內(nèi)由腸桿菌屬導(dǎo)致桑樹枯萎病提供了又一證據(jù)。通過(guò)從發(fā)病植株根部木質(zhì)部進(jìn)行病原分離,科赫氏法則驗(yàn)證及生化和分子鑒定,證明導(dǎo)致該病害發(fā)生的病原為腸桿菌屬Enterobacter sp.。同時(shí),針對(duì)分離到的4株典型菌株rpoB基因設(shè)計(jì)了特異性的引物,并對(duì)該病病原進(jìn)行了檢測(cè)。取得了

2、以下主要成果:
　　1)通過(guò)在廣東省廣州市羅崗等地進(jìn)行采樣,對(duì)新發(fā)病桑樹植株根部木質(zhì)部進(jìn)行病原分離,得到病原菌40株。采用4種接種方法對(duì)4株典型代表菌株的致病性測(cè)試表明,傷根接種法最為有效,并采用傷根接種法進(jìn)行科赫氏法則驗(yàn)證。結(jié)果表明:測(cè)試的四株典型菌株均能使桑苗葉片黃化、落葉和頂端壞死,引起桑苗枯萎和維管束變褐,并能重新分離出相同病原,接種后產(chǎn)生相同癥狀。為了探明廣州地區(qū)桑枯萎病的真正病原,通過(guò)對(duì)4株代表菌的常規(guī)細(xì)菌學(xué)、光學(xué)顯微

3、鏡和透射電鏡觀察、形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定及分子鑒定,表明這4個(gè)菌株為革蘭氏陰性,短桿狀細(xì)菌,確認(rèn)“?？菸辈槟c桿菌屬(Enterobacter spp.)所引起?！吧？菸辈∈且环N僅浙江省報(bào)道過(guò)的桑樹新病害,是Enterobacter sp.引起植物病害的又一新證據(jù)。一直以來(lái)廣州桑樹維管束病原菌都被認(rèn)為是桑青枯菌,本研究結(jié)果對(duì)認(rèn)清廣州桑樹病害具有重要的指導(dǎo)意義。
　　2)利用rpoB基因序列設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)桑細(xì)菌性枯萎病病原的引物

4、,通過(guò)Semi-nested PCR進(jìn)行?？菸〉姆肿訖z測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株桑樹細(xì)菌性枯萎病病原菌、1株桑疫病病原細(xì)菌、1株桑青枯病病原細(xì)菌,12株桑腐生(附生)菌株及4株腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)檢測(cè)后其特異性達(dá)到了預(yù)期的要求;無(wú)論是純化的菌株DNA還是桑樹表現(xiàn)或未表現(xiàn)癥狀的樣本粗懸液均能擴(kuò)增出167bp左右大小片段。因此無(wú)需經(jīng)菌株的純化,桑樹樣本制成的細(xì)菌粗懸液即可直接應(yīng)用于PCR檢測(cè)。同時(shí)對(duì)?？菸【吞镩g采集樣本的進(jìn)行靈敏性檢測(cè),發(fā)現(xiàn) DNA