土拉霉素對離體恒化器模型中人腸道菌群的影響.pdf

1、土拉霉素作為新一代大環(huán)內(nèi)酯類動物專用抗生素具有藥效持久，消除半衰期長等眾多優(yōu)點，同時土拉霉素在牛和豬可食性組織中殘留對食品安全和人體健康可能帶來不利影響也值得關(guān)注。目前國內(nèi)外對土拉霉素殘留的微生物安全性評價尚有不足之處，EMEA，F(xiàn)DA和APVMA關(guān)于其微生物學(xué)NOAEL/NOAEC的確定僅局限于短期的體外藥敏試驗中對腸道菌MIC50的測定，缺乏土拉霉素長期作用于人體腸道菌可能帶來不利影響的資料，如腸道菌群數(shù)量與結(jié)構(gòu)、菌群代謝，定植屏障

2、功能和耐藥性變化等指標(biāo)。作為新獸藥一些潛在的毒副作用尚未充分體現(xiàn)出來，因此有必要進行土拉霉素殘留對人腸道菌群影響的系統(tǒng)全面的研究，從而為制定更合理的ADI提供參考數(shù)據(jù)。同時在藥物長期選擇壓力下，人腸道條件致病菌的耐藥性和毒力特性可能發(fā)生變化，對人體健康存在潛在的致病性和危害性，本研究選擇糞腸球菌為目標(biāo)菌，闡釋細菌耐藥、毒力的變化和聯(lián)系，以及細菌致病能力的變化。
　　 1土拉霉素對人腸道菌兩個微生物學(xué)端點的影響
　　 本研

3、究采用體外連續(xù)培養(yǎng)的恒化模型來評估土拉霉素對人腸道菌群的影響，根據(jù)官方報告中土拉霉素對腸道菌MIC50值(EMEA，1.5μg/mL;APVMA，1μg/mL)和體外預(yù)實驗結(jié)果最終確定模型中土拉霉素的添加濃度分別為0，0.1，1，10和100μg/mL共5個濃度。對給藥前后兩個重要的微生物學(xué)端點定植屏障功能和耐藥性的變化進行考察，定植屏障功能變化包括三個指標(biāo)，四種優(yōu)勢菌數(shù)量變化，代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的變化和致病菌沙門氏菌的定植。
　

4、　 實驗結(jié)果為，在低劑量組(0.1和1μg/mL)，腸道菌群的定植屏障功能和耐藥性各指標(biāo)均處于95％置信區(qū)間內(nèi)，對腸道菌群無顯著性影響。中濃度組(10μg/mL)，腸球菌和脆弱擬桿菌的數(shù)量分別第18和16d后呈現(xiàn)顯著性降低，細菌數(shù)量比95％置信下限分別降低了大約1.6和6倍，其他細菌數(shù)量在正常范圍內(nèi)，短鏈脂肪酸中只有丙酸含量稍低于95％置信下限，未見鼠傷寒沙門氏菌的定植，腸球菌和脆弱擬桿菌的耐藥率呈現(xiàn)輕微上升的波動，說明此濃度下對腸道

5、菌群屏障功能和耐藥性產(chǎn)生了輕微的影響。高濃度組(100μg/mL)大腸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量較95％置信下限降低了6倍左右，脆弱擬桿菌數(shù)量降低了近100倍，腸球菌的數(shù)量卻呈現(xiàn)增長趨勢，短鏈脂肪酸乙酸，丙酸和丁酸的濃度分別降低了大約1.3，1.3和2.7倍，侵襲菌鼠傷寒沙門氏菌細菌數(shù)量維持在105-106CFU/mL，實現(xiàn)了穩(wěn)定生長，以上均說明在了高濃度組腸道菌群的屏障功能受到顯著性影響，造成了菌群紊亂和失調(diào)。結(jié)合本實驗結(jié)果和文獻報道，推測

6、腸道菌群的定植屏障功能可能與腸桿菌科的數(shù)量變化密切相關(guān)。同時，在藥物作用下大腸桿菌，腸球菌和雙歧桿菌的耐藥率均呈現(xiàn)顯著性提高，腸球菌和雙歧桿菌的耐藥率甚至達到了80％，土拉霉素對腸道菌群耐藥性的影響比其對定植屏障功能影響更加明顯。
　　 在1μg/mL下，腸道菌群耐藥性和屏障功能均未發(fā)生顯著性變化，因此其對人腸道菌群的最大無明顯副作用濃度(NOAEC)為1μg/mL，根據(jù)VICH的ADI計算公式得到其對人腸道菌群影響的微生物學(xué)A

7、DI值為4.58μg/kg.bw/day(0.27mg/person/day)，低于FDA(50μg/kg.bw/day)，EMEA(10.97μg/kg.bw/day)和APVMA(5μg/kg.bw/day)已經(jīng)制定的微生物學(xué)ADI值。
　　 2土拉霉素對糞腸球菌耐藥性和毒性的影響
　　 對藥物作用前后糞腸球菌進行分離鑒定，測定藥物作用前后糞腸球菌耐藥表型、基因型和耐藥轉(zhuǎn)移能力的變化，同時，對腸球菌中五種毒力因子表面

8、蛋白esp，細胞溶血素cylA，明膠酶gelE，膠原結(jié)合蛋白ace和聚集蛋白asal進行測定，考察細菌毒性變化和對小鼠的致病能力，并且分析細菌耐藥性和毒性的關(guān)系。
　　 實驗結(jié)果為，在土拉霉素作用前后，糞腸球菌對土拉霉素的MIC50值由4.904升高到244.149，提高了49.8倍，同時對大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類和鏈陽菌素B菌呈現(xiàn)高水平交叉耐藥，耐藥表型為典型的MLSB，且主要是由ermB基因介導(dǎo)相關(guān)(陽性率達到88.46％)，而

9、ermB基因基本上全部位于轉(zhuǎn)座子Tn1545內(nèi)，腸道菌耐藥性的顯著性提高，很可能與轉(zhuǎn)座子Tn1545介導(dǎo)的ermB基因的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 藥物作用后，糞腸球菌中一些毒力因子的表達也呈現(xiàn)明顯的變化，毒力因子esp和cylA的檢出率顯著性提高（由0升至70％），gelE的檢出率卻呈現(xiàn)顯著減低（由61.76％降至20％），同時ermB與esp，cylA之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，與gelE基因間存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測在轉(zhuǎn)座子T

10、n1545的附屬基因區(qū)內(nèi)可能同時含有耐藥基因ermB和毒力因子esp、cylA、gelE，受到相同調(diào)控區(qū)基因的調(diào)控，糞腸球菌利用可接合復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn1545實現(xiàn)耐藥基因和毒力因子的積累。
　　 含有毒力因子esp，cylA的耐藥糞腸球菌的毒性強于毒力因子陰性的菌株，腹腔攻毒后前者造成小鼠急性死亡死的時間集中在8h內(nèi)，后者造成小鼠的死亡時間相對延后，主要集中24h以內(nèi)，半數(shù)致死量LD50后者是前者的3.8倍，細菌在小鼠體內(nèi)廣泛分