低劑量替米考星對(duì)離體恒化器模型中人腸道菌群的影響.pdf

1、替米考星作為一種較新的大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素在國內(nèi)外已廣泛使用，現(xiàn)行國內(nèi)外ADI主要參考毒理學(xué)和微生物學(xué)NOAEL數(shù)據(jù)而制定。然而微生物學(xué)NOAEL的確定僅局限于對(duì)菌群中總厭氧菌群和總腸桿菌群數(shù)量以及總腸桿菌群的耐藥比例變化的監(jiān)測(cè)，低劑量替米考星長期作用于人體腸道菌群是否會(huì)產(chǎn)生其他負(fù)面影響目前尚缺乏資料考證，如優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量變化、菌群代謝的變化和定植屏障的破壞等。因此有必要進(jìn)行更系統(tǒng)深入的研究低劑量替米考星對(duì)人腸道菌群的影響，從而為制定

2、更合理的ADI提供參考數(shù)據(jù)。
　　 本研究采用接種了人糞便菌群的體外恒化模型來評(píng)估低劑量的替米考星對(duì)人腸道微生態(tài)的影響，從而評(píng)估現(xiàn)階段我國替米考星ADI安全性。在模型達(dá)到穩(wěn)態(tài)后分別連續(xù)7d添加終濃度為0、0.436μg/mL、4.36μg/mL、43.6μg/mL的替米考星，給藥前和給藥期間，監(jiān)測(cè)短鏈脂肪酸濃度、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量和兼性厭氧菌耐藥率變化。采用一元線性回歸的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀測(cè)替米考星對(duì)恒化器模型中腸

3、道菌群的影響；在給藥停止三天后開始接種108CFU/mL鼠傷寒沙門氏菌，1mL/d連續(xù)接種三天，采用培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方法監(jiān)測(cè)鼠傷寒沙門氏菌在不同給藥濃度恒化器模型中的生長趨勢(shì)，從而評(píng)估恒化器模型中人腸道菌群的屏障功能是否破壞。
　　 在替米考星給藥劑量為43.6μg/mL恒化器模型中脆弱擬桿菌和腸球菌數(shù)量均呈現(xiàn)先減少后增加現(xiàn)象，而大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量波動(dòng)范圍擴(kuò)大，分別由6.61×105-6.31×106CFU/mL和1.02×106

4、-1.23×107CFU/mL擴(kuò)大至3.02×105-1.62×107CFU/mL和5.13×105-1.35×107CFU/mL，菌群發(fā)生明顯紊亂；在濃度為4.36μg/mL的試驗(yàn)中脆弱擬桿菌數(shù)量持續(xù)下降，下降幅度達(dá)370倍，而腸球菌數(shù)量出現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量在給藥期間均處于95％下線處波動(dòng)；低劑量組恒化器模型(0.436μg/mL)中腸球菌和大腸桿菌數(shù)量未受到影響，雙歧桿菌數(shù)量給藥24h后出現(xiàn)短暫瞬時(shí)下降，而脆

5、弱擬桿菌數(shù)量波動(dòng)高于95％的置信上線。
　　 0.436、4.36和43.6μg/mL濃度替米考星均未引起恒化器模型中大腸桿菌敏感性的顯著變化；給藥劑量為0.436和43.6μg/mL的恒化器模型中腸球菌敏感性顯著下降，對(duì)16μg/mL替米考星耐藥的細(xì)菌比例顯著增加。四個(gè)不同給藥濃度的恒化器模型中乙酸和丁酸的摩爾濃度均沒有顯著變化；丙酸摩爾濃度僅在高劑量組恒化器模型（43.6μg/mL）中出現(xiàn)瞬時(shí)短暫下降現(xiàn)象，而另外三個(gè)劑量組中

6、丙酸濃度均未發(fā)現(xiàn)有顯著性變化。
　　 通過含4μg/mL環(huán)丙沙星的選擇平板進(jìn)行鼠傷寒沙門氏菌計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組含替米考星的恒化器模型中鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量與對(duì)照組比較無顯著差異，即三種藥物濃度作用后的恒化器模型中人腸道菌群屏障功能未被破壞。
　　 分別在12d、17d和20d從四個(gè)不同給藥濃度恒化器模型中采集的樣品分離糞腸球菌，檢測(cè)其中可能存在的四種毒力基因esp、cylA、asa和gelE；然后采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)攜帶

7、毒力基因的糞腸球菌對(duì)替米考星、泰樂菌素和紅霉素敏感性，同時(shí)檢測(cè)是否存在耐藥基因ermB；最后采用real-timePCR方法對(duì)各攜帶毒力基因的分離株進(jìn)行毒力基因的相對(duì)定量，探討毒力基因的表達(dá)與耐藥之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的88株糞腸球菌中僅27株攜帶gelE基因，而其他毒力基因均未檢測(cè)出；同時(shí)高劑量組恒化器模型中17d和20d分離的糞腸球菌表現(xiàn)三種大環(huán)內(nèi)酯的交叉耐藥，各分離菌株gelE基因相對(duì)定量結(jié)果顯示高劑量組恒化器第20d分離的

8、糞腸球菌gelE基因表達(dá)量相比給藥前上升了200倍，而其他菌株gelE基因表達(dá)量變化無顯著差異。
　　 綜上所述，本研究設(shè)計(jì)的替米考星三個(gè)劑量組對(duì)恒化器模型人腸道菌群均有不同程度的影響，4.36μg/mL替米考星對(duì)人腸道菌群中脆弱擬桿菌數(shù)量產(chǎn)生顯著抑制，同時(shí)0.436μg/mL替米考星對(duì)人腸道菌群中腸球菌耐藥菌產(chǎn)生顯著影響，說明不僅我國目前的ADI(40μg/kg體重)對(duì)人腸道菌群有一定的潛在危害，而且目前歐盟組織制定的ADI（

9、4μg/kg體重）也可能對(duì)人腸道菌群產(chǎn)生影響，因此要求我們制定更低的替米考星ADI來保障人類的安全。另外，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量藥物作用下可能誘導(dǎo)耐藥菌產(chǎn)生或增殖，且隨著藥物作用時(shí)間的延長誘導(dǎo)或增殖的耐藥菌本身毒力基因表達(dá)可能會(huì)表現(xiàn)一定程度的上升。這提示我們?cè)谘芯康蛣┝靠咕幬飳?duì)人腸道菌群的影響，除了監(jiān)測(cè)現(xiàn)有的因素以外，對(duì)于腸道菌群中條件致病菌毒力基因表達(dá)的變化的監(jiān)測(cè)，有助于我們更全面、更深刻的了解抗菌藥物對(duì)人腸道菌群的影響，從而做到更合理、