豬用生物發(fā)酵床墊料中微生物群落多樣性變化及芽孢桿菌分離與鑒定.pdf

1、隨著規(guī)模化養(yǎng)豬所占比例迅猛增加，帶來的環(huán)境污染成為一個(gè)亟待解決的新問題。生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)通過在墊料中原位消納生豬的排泄物，從而有效解決生豬生產(chǎn)帶來的環(huán)境污染問題。生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的核心是墊料中微生物群落的活動(dòng)，因此，生物發(fā)酵床微生物優(yōu)勢菌的選育及微生物多樣性成為近年來研究的熱點(diǎn)。
　　 本試驗(yàn)采用純培養(yǎng)法篩選高效芽孢桿菌及運(yùn)用DGGE技術(shù)對豬用生物發(fā)酵床墊料中微生物群落多樣性變化進(jìn)行研究，結(jié)果如下：
　　 1高效芽孢

2、桿菌的篩選與鑒定
　　 (1)通過對菌落形狀、表面光滑度、邊緣形狀、顏色、透明度等形態(tài)特征的識別，從發(fā)酵床樣品中純化分離了15株芽孢桿菌。
　　 (2)對分離的15株芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶檢測，篩選出5株產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力都強(qiáng)的芽孢桿菌。
　　 (3)通過對這5株高效芽孢桿菌進(jìn)行傳統(tǒng)的菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色和生理生化鑒定，結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定?？梢源_定分別為蠟狀芽孢桿菌(Baci

3、llus cereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)。
　　 2 DGGE分子生物學(xué)分析
　　 (1)提取微生物總基因組DNA，進(jìn)行16S rRNA基因V6～V8區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過對DGGE垂直梯度凝膠圖譜

4、的分析計(jì)算和多次試驗(yàn)調(diào)整，確定DGGE平行膠的變性劑濃度范圍為45%～65%后進(jìn)行平行DGGE得到保育期和育成期的生物發(fā)酵床樣品細(xì)菌DGGE圖譜。
　　 (2)通過Quantity One軟件分析DGGE圖譜發(fā)現(xiàn)：a保育期各年限、各厚度和各層次的樣品細(xì)菌DGGE圖譜中條帶豐富度明顯高于育成期樣品；b保育期和育成期中二年期樣品在各自厚度樣品中的細(xì)菌多樣性較高；c相同豬只飼養(yǎng)階段和墊料使用年限的各層次之間的細(xì)菌多樣性差異較??；d保育

5、期淺層和深層生物發(fā)酵床之間的細(xì)菌多樣性差異較小。
　　 (3)進(jìn)行條帶回收克隆測序發(fā)現(xiàn)：a在生物發(fā)酵床中存在大量未被或難被分離培養(yǎng)的微生物，這些微生物存在也發(fā)揮著一定作用，有待進(jìn)一步認(rèn)知；b雖然檢測到不少條件致病菌(如：Escherichia coli strain)，但是在這些發(fā)酵床上飼養(yǎng)的豬只發(fā)病率并不高，這可能得益于其他有益微生物的拮抗作用和豬只自身免疫力較高的原因；c對豬糞降解可能起關(guān)鍵作用的細(xì)菌和放線菌，如Bacill