土壤微生物群落磷脂脂肪酸(plfas) 生物標記多樣性分析

1、1土壤微生物群落磷脂脂肪酸（土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物標記多樣性分析）生物標記多樣性分析張秋芳1，劉波1，林營志1，唐莉娜2，史懷1，楊述省1，周先冶1（1福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建福州350003；2福建省煙草公司，福建福州350003）摘要摘要:以磷脂脂肪酸(PLFAs)作為生物標記是一種可定性和定量地分析土壤微生物群落多樣性的方法。本研究應(yīng)用生態(tài)學評價方法，即結(jié)合ShannonWiener(H1)?Bri

2、llouin(H2)?Mcintosh(H3)多樣性指數(shù)?豐富度指數(shù)(S)和Pielou均勻度(J)?Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)等各多樣性指數(shù)測度方法，以煙草土壤為例，分析土壤中微生物PLFAs生物標記的多樣性?豐富度和均勻度。研究結(jié)果表明：不同生長階段供試烤煙土壤微生物群落中，先后出現(xiàn)了43種PLFAs，PLFAs的生物量于生長后期為最高；各PLFAs的各多樣性指數(shù)?豐富度和均勻度皆不相同。根據(jù)各PLFAs生物標記的含量大小，經(jīng)聚

3、類分析后得出，可以將其依次分成五大類：Ⅰ類為高含量、高頻次和多樣性，PLFAs為18:1ω9c的真菌生物標記；第II類：含量僅次于第I類，較高頻次和多樣性指數(shù)，PLFAs為16:0的假單胞菌標記；第III類：較高含量和頻次，多樣性中等，PLFAs為16:1ω5c的甲烷氧化菌生物標記；第IV類：中等含量，頻次較高，多樣性中等，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的PLFA，還有表征厭氧細菌的18:1ω7c以及硫酸

4、鹽還原細菌的16:010Me；第V類：低含量，低頻次和多樣性，其特征生物標記有表征好氧菌的i15:03OH、15:1iG、a16:0、i16:1G、i16:1H、17:0、i17:0、15:02OH、15:03OH、17:0和17:02OH的PLFA，存在有表征真菌的18:3ω6c(6912)、放線菌的17:010Me和18:010Me以及表征原生動物的20:4ω691215c。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞:土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸(PLFAs)；

5、生物標記；多樣性ThediversityofphospholipidfattyacidsbiomarkerfthemicrobialcommunityinsoilsZHANGQiufang1LIUBo1LINYingzhi1TANGLina2SHIHuai1YANGShusheng1ZHOUXianzi1(1AgriculturalBiesourceInstitute，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalScience

6、s，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350003，China2FujianTobaccoCompany，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350003China）Abstract：Phospholipidfattyacidswasusedasakindofbiomarkerstodetectedthemicrobialcommunitydiversityqualitativelyquantitatively.Thediversityofphospho

7、lipidfattyacidsinthetobaccosoilswasanalyzedfirstlycombiningwiththeevaluation基金項目基金項目:福建省財政專項福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)基金(STIFY03)，福建省自然科學基金資助項目(B0410024)；福建省煙草專賣局科技計劃項目（閩煙科[2006]18號）；福建省農(nóng)科院預(yù)試課題(A2006YYS09)FoundationItem:Theproject

8、wassupptedbyspecificprojectofFujianFinanceftheFundofScienceTechnologyInnovationTeamofFujianAcademyofAgriculturalSciences(STIFY03)NaturalScienceFoundationofFujian(N0.B0410024)FujianTobaccoCompanyScitechnologyproject(MYK[2

9、006]No.18)PreprojectofFujianAcademyofAgriculturalSciences(A2006YYS09)作者簡介作者簡介：張秋芳（1973），女，福建閩清人碩士，副研究員，主要從事環(huán)境微生物及生化物質(zhì)分析研究。Email:qfzhang@手機手機(0)13055748230Biography:ZHANGQiufang(1973)MasterAssociateResearchermainlyengaged

10、inenvironmentalmicrobiologybiochemicalsubstanceanalyse.Email:qfzhang@通訊作者通訊作者:劉波，男，博士，研究員，主要從事微生物生物技術(shù)和微生物防治研究，Crespondedingauth:Email：fzliubo@。31材料與方法材料與方法1.1供試材料供試材料供試土壤取自福建省煙草農(nóng)業(yè)研究所試驗基地。供試烤煙品種為K326。試驗土壤為水稻土，前茬作物為水稻。供試煙田

11、土壤基本理化性狀：土壤pH值5.0有機質(zhì)20.9gkg，堿解氮99.0mgkg，速效磷8.8mgkg，速效鉀87.0mgkg，水溶性氯2.0mgkg。所用有機肥均為完全腐熟，各種有機肥養(yǎng)分含量：菜籽餅肥的全N43.0gkg，P2O528.0gkg，K2021.0gkg；雞糞（福建圣農(nóng)養(yǎng)雞場提供）全N23.0gkg，P2O529.0gk，K2034.0gkg？。煙草栽培試驗自2007年3月進行，共設(shè)不施肥（CK）、施用純化肥、25%菜籽餅

12、肥、25%雞糞4個處理，每處理重復3次。田間管理按煙草生產(chǎn)標準進行。取烤煙定植后0d（基礎(chǔ)土樣）、30d、60d和90d耕作層煙草根際土壤新鮮土樣，混勻，進行磷脂脂肪酸的提取和測試分析。1.2土壤微生物群落磷脂脂肪酸（土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物標記生物標記分析方法分析方法土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析，采用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標記法。磷脂脂肪酸的提取過程和分析參考Frostegrd和Kourtev方法[910]，操作步驟

13、為：將20ml的0.2moLL的KOH甲醇溶液和4g的新鮮土樣加到50ml的離心試管中，混合均勻，在37℃下溫育1h(脂肪酸釋放，并甲脂化，樣品10min渦懸1次)。加入3ml1.0molL的醋酸溶液中和pH值，充分搖勻。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（PLFAs）轉(zhuǎn)到有機相中，600rmin離心15min后，將上層正己烷轉(zhuǎn)到干凈試管中，在N2氣流下?lián)]發(fā)掉溶劑。將磷脂脂肪酸（PLFAs）溶解在1ml體積比為1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液

14、中用作GC分析。采用美國Agilent6890N型氣相色譜儀，包括全自動進樣裝置、石英毛細管柱及氫火焰離子化檢測器；在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，l70℃起始，5℃min升至260℃，而后40℃min升溫至310℃，維持90s；汽化室溫度250℃、檢測器溫度300℃；載氣為H2(2mlmin)、尾吹氣為N2(30mlmin)；柱前壓l0.00psi(1psi=6.895kPa)；進樣量lμl，

15、進樣分流比100:1。磷脂脂肪酸（PLFAs）的鑒定采用美國I公司(INewarkDelawareUSA)開發(fā)的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的SherlockMIS4.5系統(tǒng)(SherlockMicrobialIdentificationSystem)。1.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析（1）PLFAs生物標記指紋圖譜及其數(shù)據(jù)利用生物標記指紋圖譜及其數(shù)據(jù)利用將脂肪酸分析結(jié)果繪制成指紋圖譜圖，將相關(guān)參數(shù)列表。對指紋圖譜進行解讀和對脂肪酸分析的參數(shù)進行說

16、明，對利用的數(shù)據(jù)進行歸類。（2）PLFAs生物標記數(shù)量結(jié)構(gòu)分析生物標記數(shù)量結(jié)構(gòu)分析將分析結(jié)果重復處理計算平均值，構(gòu)建以脂肪酸生物標記為樣本，以不同處理施肥方法為指標的數(shù)據(jù)矩陣，分析特征脂肪酸生物標記在不同施肥處理土壤中的變化，揭示土壤特征微生物的變化。（3）PLFAs生物標記多樣性分析生物標記多樣性分析本研究將脂肪酸生物標記作為數(shù)量測度，引入生態(tài)學多樣性測度ShannonWiener（H1）[1112]、Brillouin（H2）[13