煙草根黑腐病菌Thielaviopsis basicola致病力分化與遺傳多樣性研究.pdf

1、煙草根黑腐病是世界性煙草病害，其病原菌為根串珠霉Thielaviopsis basicola(Berk.& Br.)Ferr.，該菌寄主范圍廣泛，可為害多種重要的農(nóng)作物。關(guān)于該病菌形態(tài)及分子遺傳多樣性研究方面國(guó)內(nèi)未見深入系統(tǒng)報(bào)道，為明確我國(guó)不同煙區(qū)煙草根黑腐病菌形態(tài)、致病力及分子遺傳多樣性，本論文開展了以下幾方面研究：
　　 (1)對(duì)我國(guó)云南、甘肅、貴州、重慶和河南5個(gè)主要產(chǎn)煙省(市)煙草根黑腐病樣品進(jìn)行病原分離，按照柯赫氏法則

2、對(duì)得到的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)合其形態(tài)特征及rDNA-ITS分子方法鑒定其所屬種。
　　 (2)測(cè)定了不同菌株菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響因子。
　　 (3)對(duì)各地代表性菌株進(jìn)行致病力差異測(cè)定，并比較了7個(gè)煙草主栽品種的室內(nèi)抗性水平。
　　 (4)詳細(xì)觀測(cè)所有菌株在V8培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和厚垣孢子特征，參照Punja&Sun的培養(yǎng)方法和分群鑒定依據(jù)對(duì)其進(jìn)行分群鑒定。
　　 (5)利用ISSR-PCR標(biāo)記技術(shù)

3、對(duì)86株來自煙草和胡蘿卜的根串珠霉菌株進(jìn)行分子遺傳多樣性分析。
　　 (6)利用顯微及超微技術(shù)探究病原菌的侵染機(jī)理。結(jié)果表明：
　　 1.從我國(guó)云南、甘肅、貴州、重慶和河南5省(市)不同煙區(qū)采集具有典型根黑腐癥狀的煙草病害樣本及病根處土壤，用改進(jìn)的胡蘿卜圓片法分離病原菌，共得到45個(gè)野生型單孢分離菌株，柯赫氏法則證病結(jié)果顯示這些菌株均為該病的致病菌，另有13株白色變異型菌株為野生型菌株室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生。形態(tài)學(xué)及rDNA-I

4、TS分子鑒定結(jié)果均顯示：所有菌株包括兩株來自胡蘿卜的參試菌株，在分類上均為根串珠霉Thielaviopsis basicola(Berk.& Br.)Ferr.。病菌rDNA-ITS序列分析結(jié)果顯示，白色變異型菌株與其野生型菌株序列一致，不同寄主來源根串珠霉rDNA-ITS序列有差異。
　　 2.選取菌落形態(tài)不同的菌株CPW1-1、CWH-1和HLL-1’，測(cè)定影響其菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的培養(yǎng)因子。結(jié)果表明：在Czapek培養(yǎng)基上

5、HLL-1’不生長(zhǎng)，CPW1-1和CWH-1可緩慢擴(kuò)展形成稀薄疏松的菌落，供試培養(yǎng)基中最適合三者生長(zhǎng)的分別為PDA、PSA和PCA。溫度對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)有明顯影響。3個(gè)菌株在5℃～35℃間均能生長(zhǎng)，最適溫度均為25℃。供試菌株在pH=4～12范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，CPW1-1、CWH-1和HLL-1’分別在pH=7、pH=10和pH=6時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，在培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，CPW1-1菌落易產(chǎn)生白色扇狀變異。除木糖外兩個(gè)野生型菌株都能有

6、效利用各種供試碳源，氮源中則是牛肉膏和酪氨酸的利用效果最好。相同光照或相同溫度條件下CPW1-1孢子萌發(fā)率均高于CWH-1，在有機(jī)營(yíng)養(yǎng)存在時(shí)，情況則相反；黑暗條件有利于孢子萌發(fā)，CPW1-1、CWH-1和HLL-1’孢子萌發(fā)的最適溫度分別是20℃、15℃和20℃。
　　 3.采用傷根接種法對(duì)15個(gè)煙草根黑腐菌株進(jìn)行致病力差異測(cè)定，并比較了7個(gè)煙草主栽品種的室內(nèi)抗性水平。研究結(jié)果表明：供試的15株煙草根黑腐病菌引致的病害程度不一，

7、病情指數(shù)從19.2～62.5不等，致病力分化明顯，其中4株表現(xiàn)強(qiáng)致病力，中等致病力菌株10株，白色變異體HLL-1’為弱致病力菌株，野生型菌株中未發(fā)現(xiàn)弱致病力菌株。不同煙草品種對(duì)同一菌株的抗性差異大，可產(chǎn)生高感、感病、中抗和抗病等不同抗性反應(yīng)；在供試的煙草品種中，貴煙4號(hào)、秦?zé)?6和中煙100有較強(qiáng)的抗病性。
　　 4.參照Punja&Sun的分群鑒定方法，將來自煙草的45個(gè)野生型和13株白色變異型共58個(gè)根黑腐菌株進(jìn)行了分群鑒

8、定。結(jié)果表明：我國(guó)煙草根黑腐病菌分離株存在明顯形態(tài)變異，共劃分出6個(gè)群，其中群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為野生型，群Ⅳ、Ⅴ為白色變異型；另有白色變異型HLL-1’菌落平展白色，厚垣孢子簇生或單生，有瓶梗孢子產(chǎn)生，形態(tài)特征明顯不同于其它群，將其建為新群-群Ⅵ。群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ及Ⅵ的分離頻率分別占41.4％、32.8％、3.4％、19.0％、1.7％和1.7％。群莊要分布重慶和云南，群Ⅱ在五個(gè)采樣省(市)均有分布，群Ⅲ和群Ⅴ僅分布在貴州，群Ⅳ主要分布在

9、重慶、河南和云南。群Ⅵ僅在河南有分布。
　　 5.以煙草根黑腐病菌基因組DNA為模板，采用單因素水平優(yōu)化的方法對(duì)Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP和模板等的濃度，以及退火溫度等幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了根串珠霉ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系，利用該體系從20個(gè)ISSR引物中篩選出6個(gè)多態(tài)性較好的ISSR引物，PCR擴(kuò)增86個(gè)不同菌株后獲得大量清晰可重復(fù)的DNA指紋圖譜，其平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為70.91％。供試總樣本的Shann

10、on多樣性指數(shù)I為0.5504，Nei’s指數(shù)h為0.3726，種群間的基因多樣度DST=0.1657，種群基因分化系數(shù)GST平均值為0.5405，大于0.5，表明供試種群具有較高的遺傳多樣性，不同寄主、不同地區(qū)來源根串珠霉存在著明顯的遺傳分化，聚類分析可將它們分成7個(gè)遺傳聚類群。
　　 6.分析以上幾個(gè)結(jié)果間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，煙草根黑腐病原菌致病力分化與其培養(yǎng)特性、形態(tài)分群之間有明顯的相關(guān)性，ISSR標(biāo)記揭示的遺傳聚類組群與菌株致