陸地棉TM-1第12部分同源染色體BAC重疊群構(gòu)建.pdf

1、棉花是世界上重要的天然纖維和油料作物。完成棉花的基因組測(cè)序及密碼解析將為棉花的遺傳改良提供重要的數(shù)據(jù)資源和平臺(tái)，有助于科研人員從分子水平上更深入的了解棉花纖維的生長(zhǎng)、發(fā)育機(jī)理，并對(duì)棉花新品種的培育及提高棉花的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性等具有重要的戰(zhàn)略意義。陸地棉TM-1是異源四倍體棉。異源四倍體棉種（AADD）是由A亞組和D亞組組成的，基因組比較大、重復(fù)序列高以及部分同源染色體基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特征揭示著四倍體基因組的測(cè)序難度大。基于細(xì)菌的插入大

2、片段克隆的全基因組物理作圖，已經(jīng)成為基因組研究中非常活躍的領(lǐng)域。DNA指紋圖譜對(duì)于基于細(xì)菌的大片段插入克隆的大規(guī)模分析和產(chǎn)生基于克隆的全基因組物理圖譜，已被證明是有效的方法。DNA指紋圖譜與細(xì)菌中DNA大片段克隆技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)成為利用插入大片段克隆進(jìn)行全基因組物理作圖研究中最為廣泛使用的方法。
　　 棉花的物理圖譜是基因組研究的基礎(chǔ)，它不僅在研究基因組組織結(jié)構(gòu)和棉種的起源進(jìn)化方面具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值，對(duì)棉花基因組的測(cè)序，重

3、要基因的圖位克隆以及大范圍的基因組分析也有重要意義。繪制高分辨率的物理圖譜是進(jìn)行測(cè)序工作的保證。本研究以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的BAC文庫(kù)及高密度遺傳圖譜為基礎(chǔ)，進(jìn)行了陸地棉TM-1第12部分同源染色體重疊群構(gòu)建，旨在為重要功能基因的圖位克隆和棉花基因組測(cè)序提供強(qiáng)有力的框架圖。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、陸地棉A12和D12染色體是比較重要的一對(duì)部分同源染色體，目前許多與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因已被定位在這兩條染色體上如無(wú)腺體

4、基因（gl2，gl3），纖維有無(wú)基因（N1，F(xiàn)b1，n2），核不育基因（ms5，ms6），致死基因（Le1，Le2）等。為了圖位克隆這些重要的農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因，需要構(gòu)建這兩條染色體的物理圖譜。以本實(shí)驗(yàn)室的高密度遺傳圖譜A12染色體上的54對(duì)標(biāo)記和D12染色體上的48對(duì)標(biāo)記進(jìn)行TM-1BAC文庫(kù)的篩選，A12染色體上25對(duì)標(biāo)記篩到了216個(gè)陽(yáng)性單克隆，D12染色體上18對(duì)標(biāo)記篩到了189個(gè)陽(yáng)性單克隆，篩選到的陽(yáng)性單克隆總數(shù)為405個(gè)。各

5、個(gè)標(biāo)記篩到的陽(yáng)性單克隆數(shù)從1到22個(gè)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室原有的基礎(chǔ)381個(gè)陽(yáng)性單克隆，將686個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行純化和BAC質(zhì)粒DNA的提取，進(jìn)行HindⅢ酶切，利用瓊脂糖方法進(jìn)行酶切指紋圖譜的分析，通過(guò)Image3.10b軟件對(duì)瓊脂糖圖片進(jìn)行分析，A12染色體上得到了387個(gè)單克隆的5，372條帶，D12染色體上得到了388個(gè)單克隆的4，843條帶，所獲得的bands文件通過(guò)FPCV9.3軟件的分析，將A12染色體的BAC單克隆和D12染色體

6、的BAC單克隆分開(kāi)構(gòu)建了A12和D12染色體的重疊群。其中A12染色體的各個(gè)引物的重疊群有77個(gè)，其contig長(zhǎng)度在53-155kb之間，連續(xù)的contig有4個(gè)，大小在277kb-5，007kb之間;D12染色體上各個(gè)引物的重疊群有82個(gè)，其contig長(zhǎng)度在61-119kb之間，連續(xù)的重疊群有7個(gè)，大小在81kb-2，407kb之間。
　　 2、多倍體植物測(cè)序的難點(diǎn)是如何有效的將部分同源染色體區(qū)分開(kāi)來(lái)。針對(duì)這一難點(diǎn)，我們選

7、取了極具代表性的7組A12染色體和D12染色體共有的標(biāo)記:NAU2715-180和NAU2715-250, NAU3441-230和NAU3441-180, NAU1151-160和NAU1151-170, NAU3293-180和NAU3293-150, NAU2251-165和NAU2251-155,NAU1237-255和NAU1237-150，NAU2356-150和NAU2356-170。由于異源四倍體棉種是由A亞組和D亞組組

8、合而成的，因此在利用這7組引物擴(kuò)增時(shí)通常會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)等位位點(diǎn)，即在海島棉Hai7124和陸地棉TM-1中均產(chǎn)生兩個(gè)等位位點(diǎn)。A12和D12染色體存在有共有標(biāo)記，這證明了兩條染色體部分同源，而A12和Dt2染色體上的共有標(biāo)記能夠篩選到相同的單克隆進(jìn)一步的說(shuō)明了A12和D12染色體部分同源，因此進(jìn)行陽(yáng)性單克隆的重疊群組裝前必須進(jìn)行A12和D12染色體的區(qū)分，將來(lái)源于A12和D12染色體的單克隆區(qū)分開(kāi)構(gòu)建重疊群。7組標(biāo)記所共有的陽(yáng)性單克隆進(jìn)行目

9、標(biāo)引物的PCR擴(kuò)增，根據(jù)帶型來(lái)進(jìn)行A12和D12染色體的區(qū)分，其中來(lái)源于NAU2715-180(A12)的單克隆有3個(gè)，NAU2715-250(D12)的單克隆有6個(gè);來(lái)源于NAU3441-230(A12)的單克隆有4個(gè)，NAU3441-180(D12)的單克隆有12個(gè);來(lái)源于NAU1151-160(A12)的單克隆有2個(gè)，NAU1151-170(D12)的單克隆有2個(gè);來(lái)源于NAU3293-180(A12)的單克隆有1個(gè)，NAU329

10、3-150(D12)的單克隆有4個(gè);來(lái)源于NAU2251-165(A12)的單克隆有1個(gè)，NAU2251-155(D12)的單克隆有3個(gè);來(lái)源于NAU1237-255(A12)的單克隆有3個(gè)，NAU1237-150(D12)的單克隆有4個(gè);來(lái)源于NAU2356-150(A12)的單克隆有10個(gè)，NAU2356-170(D12)的單克隆有6個(gè)。對(duì)這些單克隆進(jìn)行酶切指紋圖譜分析，分開(kāi)構(gòu)建了A12和D12染色體上相應(yīng)的標(biāo)記的contig，其中

11、NAU1151 A12和D12染色體上的contig長(zhǎng)度分別是94kb，73kb; NAU1237 A12和D12染色體上的contig長(zhǎng)度分別是102kb，73kb; NAU2356 A12和D12染色體上的contig長(zhǎng)度分別是159kb，111kb; NAU2715 A12和D12上的contig長(zhǎng)度分別是77kb，131kb; NAU3293 A12和D12染色體上的contig長(zhǎng)度是77kb和45kb; NAU3441 A12

12、和D12上的contig長(zhǎng)度分別是86kb，90kb; NAU2251A12和D12上的contig長(zhǎng)度是41kb和81kb。
　　 3、棉花基因組具有豐富的BAC文庫(kù)資源，是棉花基因組測(cè)序分析所必不可少的重要基礎(chǔ)。不同的參數(shù)得到的重疊群的結(jié)果是不同的，大量的BAC單克隆聚集在一起做重疊群的組裝分析所得到的結(jié)果不準(zhǔn)確。我們將A12和D12染色體的BAC單克隆區(qū)分開(kāi)來(lái)，分開(kāi)構(gòu)建出A12的1個(gè)重疊群和D12的1個(gè)重疊群;同樣將這些來(lái)

13、源于A12和D12染色體的BAC單克隆混合在一起，采用FPC軟件推薦的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，把原來(lái)分屬2個(gè)重疊群的BAC單克隆能夠錯(cuò)誤地組裝成1個(gè)重疊群。很顯然，采用低的參數(shù)設(shè)置所得到的重疊群有時(shí)是錯(cuò)誤的，是由分別來(lái)源于A12和D12部分同源染色體的單克隆聚集在一起組裝成的。因此本研究提出了在做棉花部分同源染色體的重疊群構(gòu)建工作時(shí)所采用的適宜的參數(shù)，為今后利用BAC資源進(jìn)行棉花基因組測(cè)序分析提供一種新的參考方法。公差值(Tolerance)的設(shè)

14、置能夠告訴FPC兩條被認(rèn)為是匹配的條帶的接近程度。截止點(diǎn)（Cutoff）的設(shè)置是用來(lái)控制兩個(gè)必需結(jié)合成為一個(gè)毗連群的克隆應(yīng)該有多少重疊部分。通過(guò)對(duì)FPC軟件的Tolerance值和Cutoff值進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置，以達(dá)到有效區(qū)分A12染色體上單克隆構(gòu)成的contig和D12染色體上的單克隆構(gòu)成的contig。將7組標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的BAC單克隆混合在一起進(jìn)行重疊群的組裝，Tolerance=5或6，Cutoff值=1e-12，Tolerance=7

15、，8或9，Cutoff值=1e-11或1e-12，6組標(biāo)記(NAU1151，NAU1237，NAU2715，NAU2251，NAU3293，NAU2356)分開(kāi)構(gòu)建了A12和D12染色體上的contig，Tolerance=10，Cutoff值=1e-11，5組標(biāo)記(NAU1151，NAU1237，NAU2715，NAU2251，NAU2356)分開(kāi)構(gòu)建了A12和D12染色體上的contig: Tolerance=10，Cutoff值=