余正波sod課程設(shè)計

1、<p><b>　　一、前言2</b></p><p><b>　　1.1課程目的2</b></p><p>　　1.2課程設(shè)計的要求2</p><p><b>　　二、SOD概述2</b></p><p>　　2.1 SOD簡介2</p>&

2、lt;p>　　2.2 國內(nèi)SOD研究進(jìn)展2</p><p>　　2.2.1 分離純化及性質(zhì)研究2</p><p>　　2.2.2 SOD的生物學(xué)意義及應(yīng)用研究2</p><p>　　2.3 SOD的應(yīng)用3</p><p>　　2.3.1 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用4</p><p>　　2.3.2 SOD在農(nóng)業(yè)及食

3、品工業(yè)中的應(yīng)用4</p><p>　　2.3.3 SOD在化妝品中的應(yīng)用4</p><p>　　2.3.4 SOD的其他應(yīng)用5</p><p>　　2.4 SOD的發(fā)展前景5</p><p>　　三、大蒜ＳＯＤ最佳提取條件確定及其生長過程中ＳＯＤ活力變化研究5</p><p>　　3.1 大蒜ＳＯＤ概述5&

4、lt;/p><p>　　3.2 材料和方法5</p><p>　　3.2.1 實驗材料6</p><p>　　3.2.2 提取大蒜ＳＯＤ方法的確定6</p><p>　　3.2.3 純化方法6</p><p>　　3.3 大蒜生長過程中ＳＯＤ酶活力的測定6</p><p>　　3.3.1

5、大蒜SOD的提取6</p><p>　　3.3.2 ＳＯＤ活力測定7</p><p>　　3.4 結(jié)果與討論7</p><p>　　3.4.1 大蒜ＳＯＤ最佳提取路線的選擇7</p><p>　　3.4.2純化方法的選擇7</p><p>　　3.4.3 丙酮沉淀法參數(shù)最優(yōu)化選擇7</p>&

6、lt;p>　　3.4.4 不同生長階段大蒜ＳＯＤ粗酶液活力測定8</p><p>　　3.4.5 結(jié)論和討論8</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p><b>　　一、前言</b></p><p><b>　　1.1課程目的</b><

7、/p><p>　　課程設(shè)計的目：提高學(xué)生獨立思考的能力，學(xué)會設(shè)計課程，提高學(xué)生發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力、提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。</p><p>　　1.2課程設(shè)計的要求</p><p>　　設(shè)計內(nèi)容必須包括：查找該酶的基本性質(zhì)、發(fā)展情況、應(yīng)用情況；檢測方法的確定；粗酶制品的獲得；酶粗品的精制；酶的鑒定、數(shù)據(jù)分析。</p><p><b>　

8、　二、SOD概述</b></p><p><b>　　2.1 SOD簡介</b></p><p>　　超氧化物歧化酶,別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡稱SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開始算起

9、，人們對SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。</p><p>　　2.2 國內(nèi)SOD研究進(jìn)展</p><p>　　2.2.1 分離純化及性質(zhì)研究</p><p>　　我國目前分離純化了20多種不同來源的SOD,并對其性質(zhì)作了研究

10、。結(jié)果表明:不同來源的SOD在性質(zhì)和氨基酸組成上具有高度相似性。</p><p>　　此外,國內(nèi)還報導(dǎo)了人胎肝亦含Cu·Zn·SOD(袁海平91),與成人肝及其它組織的SOD理化性質(zhì)基本一致。說明SOD在胚胎期就已開始執(zhí)行清除O了的功能。其它如人、牛、雞、馬等血,豬肝、冬菇、芥菜葉、刺梨、酵母、大腸桿菌和大豆等早幾年已分離純化。</p><p>　　2.2.2 SOD的

11、生物學(xué)意義及應(yīng)用研究</p><p>　　SOD作為一種清除O孑的酶具有廣泛的生物學(xué)意義。凡起因于O了的細(xì)胞不良反應(yīng)及其導(dǎo)致的疾病,SOD都能防止于前,治療于后。我國的研究主要測重在生物分子的保護(hù)作用、它與各種疾病的關(guān)系和對SOD的化學(xué)修飾與應(yīng)用方面?，F(xiàn)分述于后。</p><p>　　一、SOD對生物分子的保護(hù)作用：研究結(jié)果表明,SOD具有保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過氧化的作用。蠶豆葉片隨著衰老進(jìn)程S

12、OD活性逐漸下降,而丙二醛(脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物)含量急劇上升(王根軒,89)。高心病、冠心病及肝炎患者血漿丙二醛含量都顯著高于常人,且可以通過補(bǔ)充外源SOD予以治療(陳緩,87;范學(xué)士,55)。人老化紅細(xì)胞的SOD為42一24士27.17拌g/g·Hb,年輕的為481.43士一0.x3拌g/gHb,而老化紅細(xì)胞膜脂流動性明顯下降(姜招峰,89)。這些說明SOD能防止膜質(zhì)發(fā)生過氧化作用。</p><p>

13、;　　在植物體內(nèi),SOD具有保護(hù)葉綠素分子免遭逆境因子破壞的作用。許多逆境如大氣污染強(qiáng)光、輻射及鹽漬等能誘發(fā)植物體內(nèi)產(chǎn)生O孑。過量的O了使葉綠素解體。而外源SOD能抑制逆境因子引起的葉綠素分解。受逆境鍛煉的植物體內(nèi)soD含量提高,葉綠紊降解速度下降。如小麥經(jīng)HSO矛,NO矛抗性鍛煉后,體內(nèi)SOD活性提高,在高鹽濃度下,葉綠素分子被水解程度顯著減輕(李梨,89)。</p><p>　　二、SOD與各種疾病的關(guān)系SO

14、D與疾病之間的關(guān)系相當(dāng)密切。由于soD活力或數(shù)量下降使機(jī)體內(nèi)O孑濃度增加,引發(fā)膜脂過氧化作用,膜結(jié)構(gòu)破壞,功能失調(diào),必然導(dǎo)致病變。現(xiàn)已搞清與soD有關(guān)的疾病有自身免疫性疾病,心血管疾病,心肌缺血與缺血再灌注綜合癥、氧中毒、急性炎癥和水腫、肺氣腫、輻射病、老年性白內(nèi)障、乙醇中毒、衰老等。我國近幾年在SOD與腫瘤、SOD的抗炎作用等方面作了一些研究。</p><p>　　藍(lán)開蔚(87)、黃承誠(90)的研究表明:癌癥

15、患者細(xì)胞及血中SOD活性明顯低于正常細(xì)胞。正常人血液SOD含量為34.89士12.42拼g/mL、而癌癥患者的為12.43士6.03拜g/mL,二者差異非常顯著。綜合有關(guān)資料,可以認(rèn)為腫瘤細(xì)胞中SOD活性降低是其主要特點之一。為癌細(xì)胞的診斷和治療提供了一點輔助線索。</p><p>　　SOD具有較強(qiáng)的抗炎作用。以150一200mg/kg體重的劑量腹腔注射小白鼠,然后用角叉菜膠誘發(fā)其足腸腫脹;用巴豆油誘發(fā)其耳片腫

16、脹,結(jié)果表明誘發(fā)劑對注射了SOD的小白鼠無效。另外,SOD對大白鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎也有明顯的抑制作用(林秀坤,86;袁偉,86)。這一結(jié)果對SOD用于炎癥防治提供了一個有力的佐證。</p><p>　　另外,馬蔚(91)的工作說明膠原病與SOD含量亦有關(guān)。治療膠原病應(yīng)予以SOD補(bǔ)充,人為提高SOD活性。</p><p>　　三、對SOD的化學(xué)修飾研究SOD用于臨床有一個致命的弱點—在體內(nèi)的半衰

17、期極短,一般僅4—10分鐘。這一間題的解決辦法目前主要運用SOD表面修飾和脂質(zhì)體包裹。對后者,我國已成功地研究制出了能延長SOD在體內(nèi)存在時間的脂質(zhì)體制劑。對前者,我國主要研究了用右旋糖昔(吳云,86,88)和聚乙二醇(飛耀華,89)作修飾劑。結(jié)果表明,修飾酶仍能保持75—80%的活性,大大延長了SOD的半衰期。右旋搪昔修飾的SOD在小鼠體內(nèi)的半衰期由天然SOD的4,06分延長到41.46分,提高10倍多。其所以能延長,一般認(rèn)為是糖分子

18、增加了soD表面親水性,使其表面形成水化層—猶如保護(hù)膜,使SOD受到保護(hù),這一研究不僅提高SOD臨床應(yīng)用價值,也為SOD的口服開辟了有效途徑。</p><p>　　特別值得注意的是莊華云(90)的研究。它發(fā)現(xiàn)了Cu的二膚絡(luò)合物:</p><p>　　L一His一X一Cu(x為L一Ala或L一Tyr或L一Phe)具有類似SOD的活性。顯然,短膚</p><p>　　絡(luò)

19、合物較SOD更具臨床優(yōu)勢:易于人工合成,更易于進(jìn)入細(xì)胞。</p><p>　　四、應(yīng)用研究SOD在美德等國已有產(chǎn)品用于臨床,主要用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及放射治療后引起的炎癥,也用于自身性免疫病、肺氣腫、氧中毒等治療。我國除研制出soD脂質(zhì)體用于臨床外,貴州研制了SOD強(qiáng)化的刺梨汁糖漿(89)也已上市,開辟了植物SOD應(yīng)用的先例,而且證明了SOD的口服有效性。它的意義還在于減少了SOD制備環(huán)節(jié),成本大大降低。另外,S

20、OD做為</p><p>　　添加劑加入化妝品,使化妝品具有防輻射、防衰老的作用。目前,我國正在制定食用型和化妝型SOD檢測與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。它將為SOD更廣泛深入的應(yīng)用起推動作用。</p><p>　　綜上所述,SOD的研究在我國是較為廣泛深入的。分離純化了20多種動植物的SOD并進(jìn)行了性質(zhì)研究,占世界總數(shù)的三分之二。獨特地鑒定了人胎肝SOD與成人的一致;研究了SOD與癌癥、炎癥、腦損傷等疾病

21、的關(guān)系,為臨床應(yīng)用提供了可靠的理論根據(jù)。尤其是SOD的修飾研究,使S()D的國產(chǎn)化成為可能。SOD強(qiáng)化的刺梨汁糖漿的臨床應(yīng)用更是獨具特色。值得一提的是中國醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所和海軍總院分子生物學(xué)研究所成功地將人血SOD基因克隆到大腸桿菌,表達(dá)率達(dá)50%,超國外15%。但在SOD的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及催化機(jī)制方面的研究尚顯不足。此方面除得出Cu為催化基團(tuán)(袁勤生,91)、Cl一對SOD活性有明顯抑制作用(鄧碧玉,‘91)外,極少報導(dǎo)。</p

22、><p>　　2.3 SOD的應(yīng)用</p><p>　　2.3.1 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用</p><p>　　人類機(jī)體所處的環(huán)境復(fù)雜,體內(nèi)經(jīng)常不斷地產(chǎn)生自由基,特別在病理過程中,產(chǎn)生大量的O-2 ,這些O-2 反過來促進(jìn)病情加重,因而SOD在清除O-2 中則顯得異常重要。肺氣腫是由于肺組織的中性白細(xì)胞含彈性蛋白酶及彈性蛋白酶抑制劑不平衡所致。彈性蛋白酶抑制劑有α-蛋白酶抑制劑

23、及支氣管粘膜蛋白抑制劑兩種,均可受O-2 攻擊而失活,導(dǎo)致肺氣腫。</p><p>　　環(huán)境污染物(如:O3、氮、硫等)能提高肺的巨噬細(xì)胞的活力而不斷釋放O-2 ,吸煙也會使自由基大量進(jìn)入肺內(nèi)。在肺中,O-2 產(chǎn)生破壞性極強(qiáng)的·OH等,O-2 和·OH攻擊彈性蛋白酶抑制劑,使其失活,而造成肺氣腫。</p><p>　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病是由于機(jī)

24、體喪失阻止自身組分的抗體形成,而產(chǎn)生自體抗體。這些抗體與正常的機(jī)體級組分結(jié)合,引起吞噬細(xì)胞吞噬而表現(xiàn)出病理狀態(tài)。吞噬細(xì)胞在吞噬過程中產(chǎn)生大量的O-2 ,O-2 攻擊機(jī)體而加劇病變。機(jī)體受原子彈、氫彈的輻射沖擊,從事放射輻射工作而防護(hù)不良的工作人員,受電離輻射后,成各種不同產(chǎn)物,且產(chǎn)物又發(fā)生連鎖反應(yīng),生成許多自由基而攻擊人體,導(dǎo)致輻射病。</p><p>　　(人體內(nèi)) H2O 　x - 射線γ- 射線　x - 射

25、線γ - 射線O -2 + ·OH + ·HSOD的增加能抑制因輻射而引起的腫瘤的形成,并增加成纖維細(xì)胞的分化能力, 有效地防止腫瘤的惡性發(fā)展。</p><p>　　另外,某些藥物中毒、氧中毒、大氣污染綜合癥和老年性白內(nèi)障等疾病的發(fā)生均與O2 - 相關(guān)聯(lián)。機(jī)體內(nèi)的O-2 可以引起各種疾病, SOD作為O-2 的天然清除劑,在正常情況下,O-2 與SOD保持動態(tài)平衡,但在病理狀態(tài)下,產(chǎn)生過量的O

26、-2 ,機(jī)體本身產(chǎn)生的SOD 能完全清除這些過多的O-2 ,這些過多的O-2 則對機(jī)體產(chǎn)生危害。SOD可以催化O-2 進(jìn)行歧化反應(yīng),減輕O-2 對上述疾病的作用。</p><p>　　機(jī)體內(nèi)含有SOD,并且機(jī)體組織中的SOD還會隨著年齡的增加而增加,如J. Hollander研究[ 5 ]發(fā)現(xiàn)隨著人年齡的增加,腓腸肌中SOD的活性也在增加。但是,機(jī)體自身產(chǎn)生的SOD是有限的,因此在疾病治療中可以通過注射或口服SO

27、D藥物增加機(jī)體中的SOD,達(dá)到治療疾病的作用。</p><p>　　2.3.2 SOD在農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)中的應(yīng)用</p><p>　　SOD在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)能不同程度地提高植物對逆境的抵抗能力,MnSOD基因的過量表達(dá)在一定程度上可以提高植物轉(zhuǎn)基因植物對氧脅迫的耐受性。通過基因工程手段,增加植物內(nèi)的SOD的表達(dá),可以大大增強(qiáng)植物的抗逆性。如[ 3 ]將存在于線粒體中的Mn - SOD

28、 導(dǎo)入煙草、苜蓿的葉綠體后,其轉(zhuǎn)基因植株可以增加對臭氧及干旱脅迫的抗性。擬蘭芥[ 4 ]的Fe - SOD 基因轉(zhuǎn)化煙草葉綠體, Fe- SOD 的過量表達(dá)能夠增強(qiáng)葉綠體質(zhì)膜和光合系統(tǒng)Ⅱ?qū)V (甲基紫精) 和高鹽過氧化脅迫的抗性。</p><p>　　SOD在食品工業(yè)中的應(yīng)用也比較廣泛。在食品中加入SOD可以增強(qiáng)抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健作用。SOD還可以在罐頭食品、果汁、啤酒等食品中作為抗氧化劑,防止

29、過氧化化物酶引起的食品變質(zhì)和腐敗現(xiàn)象;還可以作為水果和蔬菜的保鮮劑。</p><p>　　2.3.3 SOD在化妝品中的應(yīng)用</p><p>　　研究證明，SOD添加于化妝品中可起到4方面的作用:一是有明顯的防曬效果,光照使皮膚變黑的主要原因是氧自由基損害, SOD可有效防止皮膚受電離輻射(特別是紫外線)的損傷,從而起到防曬效果;二是SOD為抗氧酶,能有效防止皮膚衰老、祛斑、抗皺;三是有明

30、顯的抗炎效果,對防治皮膚病有一定效果;四是SOD具有一定的防治斑痕形成的作用。</p><p>　　SOD在化妝品中妝品應(yīng)用廣泛, SOD也被用于化妝品中,如我國的大寶SOD蜜,用于防止皮膚衰老,另一些含SOD量高的藥物如人參、三七、黃芪等也受到重視。</p><p>　　2.3.4 SOD的其他應(yīng)用</p><p>　　目前, 生物無機(jī)化學(xué)家們合成和表征了一系列含

31、銅、錳、鐵等金屬離子的小分子配合物來模擬SOD, 期待將來能用小分子模擬化合物代替SOD應(yīng)用于臨床。其中研究最多的含銅絡(luò)合物是3, 5- 二異丙基水楊酸銅[ Cu( 3, 5-D IPS) ] , 這是一種低分子量的親脂性絡(luò)合物, 具有天然Cu /Zn-SOD 樣活性, 可以起到抗炎及減輕由鏈脲菌素誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖尿病。合成的鐵( II ) -酪氨酸模擬SOD 金屬酶, 分子量比天然酶小得多, 與天然SOD活性差距較小, 且毒性小, 從而大

32、大推進(jìn)了人工合成具有分子質(zhì)量較小、穩(wěn)定性高、毒性較底、活性較高等優(yōu)點的SOD模擬物的研究工作。</p><p>　　2.4 SOD的發(fā)展前景</p><p>　　雖然對SOD的研究廣泛,但是SOD的臨床應(yīng)用仍有一定的困難,如靜脈注射, SOD在體內(nèi)半衰期僅為6分鐘,口服是否會在胃腸道中被破壞而失去療效,口服后能否被吸收等問題還有待解決。但可以設(shè)想,隨著對SOD研究的日益深入, SOD作為一

33、種新型酶制劑,在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健品、食品等方面必將得到廣泛的應(yīng)用。</p><p>　　SOD研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展, 研究內(nèi)容不斷深化。然而, 仍有許多問題有待于進(jìn)一步研究。理論研究方面,如對SOD 進(jìn)行化學(xué)修飾后, 修飾酶的代謝過程及其毒副作用等方面都需要深入研究; 應(yīng)用研究方面, 也有一些問題急待解決: a) 臨床應(yīng)用方面需進(jìn)一步闡明SOD在體內(nèi)的抗氧化過程, 延長SOD 在體內(nèi)的半衰期, 減少其對機(jī)體的毒副作用

34、等，食品工業(yè)方面, 要確?？诜OD有效性, 使之不被胃蛋白酶分解等化妝品應(yīng)用方面, 要準(zhǔn)確地測定SOD 的活性大小, 同時要明確化妝品基質(zhì)對SOD 活性和穩(wěn)定性的影響等。隨著研究的不斷深入, SOD的應(yīng)用前景將更為廣闊。</p><p>　　三、大蒜ＳＯＤ最佳提取條件確定及其生長過程中ＳＯＤ活力變化研究</p><p>　　3.1 大蒜ＳＯＤ概述</p><p>

35、　　大蒜是人們喜愛的一種香辛蔬菜和調(diào)味料，歷來被認(rèn)為具有保健和治療作用，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，其活性物質(zhì)主要是蒜氨酸和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）。ＳＯＤ是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除劑，具有抗衰老，提高機(jī)體對多種疾病的抵抗力；增強(qiáng)機(jī)體對外界環(huán)境的適應(yīng)力；減輕腫瘤患者在放療、化療過程中的嚴(yán)重毒副作用等生理功能。所以在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方而具有廣泛的應(yīng)用。大蒜中ＳＯＤ含量較高，其活性是一般果蔬的數(shù)倍，被認(rèn)為是人類重要的ＳＯＤ來源。&l

36、t;/p><p>　　開發(fā)大蒜中的ＳＯＤ產(chǎn)品成為人們關(guān)注的熱點。若以傳統(tǒng)的以牲畜血液為原料提?。樱希漠a(chǎn)品，不但生產(chǎn)成本高，而且可能會危及生態(tài)的平衡。若以大蒜為原料，不僅節(jié)省生產(chǎn)成本，還拉動經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。本論文在前人研究的基礎(chǔ)上，以河南大蒜為原料，選取最佳的大蒜ＳＯＤ提取工藝，分離提取大蒜不同生長階段的ＳＯＤ粗酶液，測定大蒜不同生長階段的ＳＯＤ酶活力，確定大蒜在哪個生長階段的ＳＯＤ的酶活力最高，為今后提取不同生長階段的大

37、蒜的ＳＯＤ 粗酶或者開發(fā)ＳＯＤ產(chǎn)品提供一個較優(yōu)的選擇依據(jù)。</p><p><b>　　3.2 材料和方法</b></p><p>　　3.2.1 實驗材料</p><p>　　河南新鮮白皮大蒜，０?０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ｐＨ 為７．８使用９１．５ｍＬ０．０５ｍＬ／Ｌ?。危幔龋校希磁c８．５ｍＬ?。埃埃担恚铮欤獭。危幔龋玻校希磁渲枚桑?；

38、氯仿－乙醇混合液（氯仿∶乙醇為３∶５）；丙酮：用前冷卻到４℃；０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸緩沖液（ｐＨ 為１０．２使用７０ｍＬ０．０５ｍｏｌ／Ｌ?。危幔玻茫希撑c３０ｍＬ?。埃埃担恚铮欤獭。危幔龋茫希撑渲枚桑?；０．１ｍｏｌ／Ｌ?。牛模裕寥芤海?zhǔn)確稱取乙二胺四乙酸二鈉３．７２２ｇ溶解于１００ｍＬ蒸餾水中）；２ｍｍｏｌ／Ｌ腎上腺素（用現(xiàn)成的１ｍｇ／ｍＬ鹽酸腎上腺素注射液配置，在其基礎(chǔ)上加入１．３３ｍＬ蒸餾水。</p><p

39、>　　ＦＡ１００４Ｂ電子天平　上海精密儀器有限公司；ＫＤＣ－１６高速離心機(jī)、國華企業(yè)ＳＨＡ－Ｂ型水浴振蕩鍋、Ｔ６新世紀(jì)紫外可見分光光度計　北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。</p><p>　　3.2.2 提取大蒜ＳＯＤ方法的確定</p><p><b>　　粗提取方法:</b></p><p>　　磷酸緩沖液法：將蒜瓣去外膜，置于研缽中研磨

40、至蒜泥狀，加入３ 倍體積的磷酸緩沖液，浸泡３０～４５ｍｉｎ后用６層紗布抽濾，將濾渣再用２倍體積磷酸緩沖液浸泡３０ｍｉｎ后，６層紗布抽濾。如此反復(fù)共３次，收集３次抽濾所得濾液，測酶活力。</p><p>　　熱變性法：將大蒜中ＳＯＤ 酶液于６０ ℃熱處理２０ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，棄沉淀，測定上清液酶活力。</p><p>　　混合法（磷酸緩沖液法＋熱變性法）：破碎后的大蒜

41、組織中加入三倍體積的０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ｐＨ為７．８），繼續(xù)研磨２０ｍｉｎ，使ＳＯＤ充分溶解到緩沖液當(dāng)中，然后在５０００ｒ／ｍｉｎ下離心１５ｍｉｎ，取上清液。</p><p>　　3.2.3 純化方法</p><p>　　氯仿－乙醇沉淀法：將氯仿－乙醇混合液，按酶液體積的０．２５將其加入酶液中，攪拌１５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，棄沉淀，將上清液置于試管中靜１０ｍｉ

42、ｎ后測其ＳＯＤ酶活力。</p><p>　　丙酮沉淀法：粗酶液中加入０．６倍體積的冷丙酮，攪拌１５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，得到ＳＯＤ沉淀，將ＳＯＤ沉淀溶于磷酸緩沖液中，于５５～６０℃熱處理1５ｍｉｎ，</p><p>　?。担埃埃埃颍恚椋铍x心１５ｍｉｎ，崎嶇得到ＳＯＤ酶液。</p><p>　　3.3 大蒜生長過程中ＳＯＤ酶活力的測定</p

43、><p>　　3.3.1 大蒜SOD的提取</p><p>　　取未種植的大蒜及不同生長階段的大蒜蒜瓣各５ｇ，分別置于１～６研缽中研磨。進(jìn)行組織細(xì)胞破碎。</p><p>　　ＳＯＤ的提?。郏常萜扑楹蟮慕M織中加入三倍體積的０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ｐＨ 為７．８），繼續(xù)研磨２０ｍｉｎ，使ＳＯＤ充分溶解到緩沖液當(dāng)中，然后在５０００ｒ／ｍｉｎ 下離心１５ｍｉｎ，取上清液

44、。</p><p>　　除雜蛋白上清液中加入０．２５體積的氯仿－乙醇混合液攪拌１５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，得到的上清液即為粗酶液。</p><p>　?。樱希牡某恋矸蛛x粗酶液中加入０．６倍體積的冷丙酮，攪拌１５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，得到ＳＯＤ沉淀，將ＳＯＤ沉淀溶于磷酸緩沖液中，于５５～６０ ℃ 熱處理１５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，棄去沉

45、淀，得到ＳＯＤ酶液。</p><p>　　3.3.2 ＳＯＤ活力測定</p><p><b>　　表1腎上腺素法</b></p><p>　　取三個對照管，混合均勻，在３０ ℃水浴中預(yù)熱５ｍｉｎ加入腎上腺素后，繼續(xù)保溫２ｍｉｎ，然后立即在３２５ｎｍ處測定光密度。對照管和樣品管的光密度值分別為Ａ和Ｂ。</p><p>　　

46、在上述的實驗條件下，將ＳＯＤ抑制腎上腺素自氧化５０％所需要的酶量定義為一個酶活力單位。</p><p>　　酶活力（單位）＝［２（Ａ－Ｂ）Ｎ］／Ａ；其中Ｎ為樣品稀釋倍數(shù)；２為抑制腎上腺素自氧</p><p>　　化５０％的換算系數(shù)。</p><p>　　酶活力單位／ｍＬ＝酶活力單位×（Ｖ１／Ｖ）；其中，Ｖ 為反應(yīng)液體積（６．５ ｍＬ）；Ｖ１ 為樣品液體積（

47、０．５ｍＬ）。</p><p><b>　　3.4 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.4.1 大蒜ＳＯＤ最佳提取路線的選擇</p><p>　　粗提取方法的選擇表２不同方法粗提取是ＳＯＤ的吸光度Ａ），其中Ａ１，Ａ２，Ａ３分別為磷酸緩沖液、熱變性和以上兩種方法的混合粗提ＳＯＤ的測定值。由表２計算可知：磷酸緩沖液提取法所得的酶活力為１０．

48、４７３；經(jīng)熱變性處理的大蒜ＳＯＤ粗酶液的酶活力為１６．４７３；混合法所得的酶活力為１８．１０９。由此可見，在進(jìn)行粗提的方法選擇上，應(yīng)選擇混合提取法，即磷酸緩沖液法＋熱變性法。</p><p>　　表２不同方法粗提時ＳＯＤ的吸光度</p><p>　　3.4.2純化方法的選擇</p><p>　　表３為不同方法純化時ＳＯＤ的吸光度（Ａ），其中Ａ４，Ａ５分別為氯仿－乙醇

49、沉淀法和丙酮沉淀法時所得ＳＯＤ的吸光度。由表３計算可得，通過氯仿－乙醇沉淀法提純ＳＯＤ粗酶液的酶活力為１１．２３６；通過丙酮沉淀法提純大蒜ＳＯＤ粗酶液的酶活力為１５．２７３。由此可見，丙酮沉淀法是純化效果較好的一種方法。</p><p>　　表３不同方法純化時ＳＯＤ的吸光度</p><p>　　3.4.3 丙酮沉淀法參數(shù)最優(yōu)化選擇</p><p>　　在相同體積的粗

50、酶液中，分別加入０.４倍（Ｖ１）０．６倍（Ｖ２），０．８倍（Ｖ３），１．０倍（Ｖ４）的丙酮，然后測其酶活力，其結(jié)果見表４，由表４計算得，在粗酶液中加入０．４，０．６，０．８，１．０倍體積的丙酮后其酶活力分別為３．２７３，１１．３４５，９．９２７，９．６；由此可見，加入０．６倍體積的丙酮時ＳＯＤ酶活力最高。</p><p>　　表４加入不同體積丙酮后ＳＯＤ的吸光度</p><p>　　3.4

51、.4 不同生長階段大蒜ＳＯＤ粗酶液活力測定</p><p>　　表５　不同時期大蒜ＳＯＤ的吸光度、酶活力和酶活力單位</p><p>　　由圖１可以清晰的看出，大蒜生長天數(shù)與ＳＯＤ酶活力的變化關(guān)系：未種植的大蒜ＳＯＤ酶活力為０．５０２，在大蒜生長７天時，其ＳＯＤ酶活力有明顯的上升，在緊接著的一周的生長過程中，大蒜的ＳＯＤ酶活力有急劇的下降，初步分析，可能是打算生長時，消耗了有機(jī)物，而這些有

52、機(jī)物也許會直接或間接的影響到ＳＯＤ酶活力。在大蒜生長的第３周和第４周時，其酶活力又得到了明顯的提升。而在實驗的最后１周中，大蒜的ＳＯＤ酶活力變活已經(jīng)沒有太大的變化。</p><p>　　3.4.5 結(jié)論和討論</p><p>　　三種粗提取方法和兩種純化方法各自有其的優(yōu)點，但就本課題來說，最佳的提取工藝路線為：用混合</p><p>　　法（磷酸緩沖液法＋熱變性法）

53、進(jìn)行粗酶液的提?。挥帽兓ㄟM(jìn)行酶液在純化，丙酮用量為０．６倍體積粗酶液同時攪拌１５ｍｉｎ。</p><p>　　一般在泡菜發(fā)酵過程中可以根據(jù)ｐＨ 下降的快慢分為發(fā)酵初期、發(fā)酵旺盛期和發(fā)酵末期三個階段；在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中的ｐＨ 均呈下降趨勢，而甘藍(lán)中的酸含量（以總酸含量代替）同時較快上升，待發(fā)酵成熟期過后，乳酸含量稍有下降，這與真菌的增殖有關(guān)，真菌為耐酸性菌，它的增殖能夠降低發(fā)酵液中的有機(jī)酸（如乳酸，醋酸等

54、）使ｐＨ 有所回升。ｐＨ 的降低和乳酸菌的增加能夠抑制發(fā)酵體系中其他微生物的生長，如除乳酸菌外的需氧嗜溫菌和腸道菌的減少，同樣結(jié)果也見于其他發(fā)酵產(chǎn)品［１０，１１］，有資料報道ｐＨ?。常怠矗澳軌蛞种颇c道菌和革蘭氏陰性菌［１２］。除乳酸菌外乳酸也能抑制腸道菌［１３］。</p><p>　　本次實驗研究表明在甘藍(lán)發(fā)酵過程中，加入食醋能夠迅速地促進(jìn)乳酸菌的繁殖，從而加快發(fā)酵的速度，</p><p

55、>　　比自然發(fā)酵完成提前了１天，加入發(fā)酵液中的食醋以白醋為好，加入醋的濃度以０．６％為最適濃度。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 丁書茂,楊旭.超氧化物歧化酶及其模擬化合物研究進(jìn)展[J].高等函授學(xué)報(自然科學(xué)版),2004,17(1):1～5.</p><p>　　[2] 張曉燕.超氧化物歧化酶

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