類(lèi)芽孢桿菌Bg1種的鑒定及其抗菌蛋白的研究.pdf

1、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是多種植物重要的維管束病害，病原菌多為引起系統(tǒng)性侵染、土壤傳播的病害。其多個(gè)專(zhuān)化型能引起甘藍(lán)、香蕉、番茄和瓜類(lèi)等植物的枯萎病，在生產(chǎn)上的危害十分嚴(yán)重。目前利用生物防治來(lái)控制病害是安全、有效的措施之一。類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）由于能產(chǎn)生豐富的抗菌物質(zhì)，是植物病害的有效的生防菌株。本實(shí)驗(yàn)是在劉霞初步將Bg1定為類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）工作的基

2、礎(chǔ)上開(kāi)展工作。通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)及 DNA-DNA雜交等分子生物學(xué)技術(shù)，確定了生防菌株Bg1的分類(lèi)地位；對(duì)類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）Bg1抗菌蛋白的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，明確菌株 Bg1對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌的抑制作用，為明確生防菌株Bg1的抑菌機(jī)理提供了理論依據(jù)和利用該菌株開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。
　　通過(guò)16SrDNA、ropB基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析、G+Cmol％含量測(cè)定、與相近菌株的生理生化比較分析、脂肪酸

3、含量測(cè)定以及 DNA-DNA雜交分析，對(duì)類(lèi)芽孢桿菌 Bg1進(jìn)行了種的鑒定。菌株 Bg1與 Paenibacillus elgii SD17T、Paenibacillus ehimensis EAG5T的16SrDNA同源性均為99%；ropB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株Bg1與P.elgii SD17T的同源性為99%，與 P.ehimensis EAG5T同源性為89%；菌株 Bg1與 P.elgii SD17T、P.ehimensis EAG5

4、T生理生化特征不吻合的項(xiàng)目較多；菌株Bg1的脂肪酸組成與P.elgii SD17T有四項(xiàng)不一致，而與P.ehimensis EAG5T有五項(xiàng)不一致；DNA-DNA雜交結(jié)果顯示菌株Bg1與P.elgii SD17T有最高基因組相似性，為80.17±2.77%，而與P.ehimensis EAG5T基因組相似性?xún)H為25±2.68%。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果將菌株Bg1確定為埃吉類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus elgii）。
　　使用6

5、0%硫酸銨沉淀、DEAE-Sephadex A50離子交換層析及Sephadex G100凝膠過(guò)濾層析對(duì)菌株Bg1的抗菌蛋白進(jìn)行了分離純化，以SDS-PAGE對(duì)該抗菌蛋白進(jìn)行了純度檢測(cè)，以肽質(zhì)量指紋圖譜和MALDI-TOF-TOF-MS/MS對(duì)該抗菌蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。Bg1無(wú)菌發(fā)酵濾液經(jīng)三步純化后得具有抑菌活性的單一電泳條帶蛋白組分，其分子量約10 KD。質(zhì)譜結(jié)果表明，Bg1產(chǎn)生的活性蛋白都是一些水解的小分子肽。類(lèi)芽孢桿菌Bg1主要抗

6、菌活性物質(zhì)為低分子量抗菌蛋白，其對(duì)環(huán)境因子穩(wěn)定性較好，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛能。
　　使用菌株Bg1的發(fā)酵液測(cè)定其對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. Conglutinans）孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響。通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，測(cè)定菌株 Bg1對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌菌落和菌絲的影響。結(jié)果表明，Bg1發(fā)酵液對(duì)孢子的萌發(fā)和菌落的生長(zhǎng)均有顯著的影響，發(fā)酵液有效抑制濃度均為4倍，對(duì)孢子的抑制率在88%以上；Bg1菌落與甘藍(lán)枯萎病菌菌落之間