枸杞LmP5CS基因克隆及表達分析.pdf

1、枸杞為我國西北地區(qū)特有的耐鹽堿植物,有著很強的抗逆性?？寺¤坭骄幋a脯氨酸的關(guān)鍵酶基因,對枸杞的抗逆機理、P5CS基因的完善與進化有著重要的意義。而且這為進一步抗逆基因改組提供了材料,利用分子技術(shù)快速完成抗逆基因的上萬年進化,為獲得抗逆功能強大的基因奠定基礎(chǔ)。本論文主要包括以下幾方面的內(nèi)容:
　　1.鹽脅迫后,提取枸杞葉片總RNA,利用3'RACE技術(shù)首次從枸杞中分離了Δ′-吡咯啉-5-羧酸合成酶(delta′-pyrroline-

2、5-carboxylatesynthetase,P5CS)基因,命名為LmP5CS,然后與克隆載體pMD-18T連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。對LmP5CS基因進行系統(tǒng)序列分析,LmP5CS的cDNA全長為2245bp,其中包含2154bp的ORF,編碼717個氨基酸。利用生物信息學對LmP5CS基因編碼的氨基酸進行系統(tǒng)分析。預(yù)測該蛋白分子量約77.5kD,理論等電點為6.07。LmP5CS包含有高等植物P5CS蛋白質(zhì)的6個主要功能結(jié)構(gòu)域:AT

3、P結(jié)合位點,NADPH結(jié)合位點,兩個亮氨酸結(jié)構(gòu)域,谷氨酰激酶(GK)和谷氨酸半醛(GSA)結(jié)構(gòu)域。通過蛋白保守模塊分析,預(yù)測LmP5CS的保守結(jié)構(gòu)域,其具有顯著性的模塊依然為氨基酸激酶和乙醛脫氫酶,由此可見,LmP5CS具有氨基酸激酶和乙醛脫氫酶功能結(jié)構(gòu)域。
　　2.構(gòu)建含有LmP5CS目的基因的植物表達載體pH7m24GW,3rc-LmP5CS,經(jīng)菌落PCR、提質(zhì)粒酶切驗證后,證明目的基因已正確連入表達載體中。獲得了含有pH7m