熱加工處理轉(zhuǎn)Bt水稻基因的降解及其檢測(cè)研究.pdf

1、在我國(guó)自主轉(zhuǎn)Bt基因水稻快速發(fā)展的背景下，針對(duì)目前對(duì)其在加工品中的檢測(cè)還沒(méi)有系統(tǒng)研究的情況下，本研究利用外源模擬熱加工的方法，選取我國(guó)目前幾個(gè)成熟的轉(zhuǎn)Bt基因水稻作為研究對(duì)象，研究適合含有米質(zhì)品加工品的DNA提取方法，并研究轉(zhuǎn)Bt基因水稻不同加工過(guò)程內(nèi)、外源基因及Bt蛋白含量的降解規(guī)律，建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，完善加工品轉(zhuǎn)基因成份的檢測(cè)規(guī)程，為轉(zhuǎn)基因成份的檢測(cè)和溯源提供技術(shù)支持，對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管具有重要意義。主要研究結(jié)果如下：

2、　　1.DNA提取方法研究：本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了5種不同方法提取轉(zhuǎn)Bt基因水稻（Bt-ZJ22）及含有米質(zhì)品的加工品DNA的效果。以確定適合轉(zhuǎn)基因水稻及其加工品DNA的提取方法，為后續(xù)建立轉(zhuǎn)基因水稻及其加工品的PCR檢測(cè)方法莫定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示CTAB法和堿處理法所提取的DNA得率較高；在純度上5種方法相差不大；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)5種方法提取的DNA完整性顯示所有樣品提取的DNA均嚴(yán)重降解；在以水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Wizardk

3、it法擴(kuò)增效果最好，能夠滿足PCR定性鑒定的需要，而且提取過(guò)程簡(jiǎn)單、快速。綜合考慮，Wizardkit法更適合于轉(zhuǎn)基因水稻及其加工品PCR檢測(cè)中DNA模板的制備。
　　2.熱加工處理對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻內(nèi)外源基因的影響：采用高溫滅活、水煮、高溫烘干和微波4種外源模擬熱加工的方法處理3種轉(zhuǎn)Bt基因水稻（KMD1、TT51-1和KF6），按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS、調(diào)控元件CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子、外源基因Bt進(jìn)行定性P

4、CR檢測(cè)，研究目前對(duì)這三種轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法是否適合檢測(cè)其在加工品中的成份。并針對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻外源基因各個(gè)片斷（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/Cry1Ac等）利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，對(duì)水稻內(nèi)源SPS基因和外源Bt基因進(jìn)行不同大小片段的PCR擴(kuò)增，了解轉(zhuǎn)Bt基因水稻在模擬熱加工過(guò)程中內(nèi)、外源基因的降解規(guī)律，尋找外源基因在加工品中的穩(wěn)定區(qū)域。研究結(jié)果表明，三種Bt基因在熱處理過(guò)程中的降

5、解情況不盡相同。熱加工過(guò)程無(wú)論對(duì)內(nèi)源基因和外源插入基因的檢測(cè)都有影響，轉(zhuǎn)基因水稻中的各種外源成分在不同加工條件下穩(wěn)定性不同。本文新設(shè)計(jì)的引物可以成功的用于轉(zhuǎn)基因水稻及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)。
　　3.熱加工處理對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻蛋白含量的影響：實(shí)驗(yàn)中采用ELISA方法測(cè)定了不同熱加工處理轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子中Bt蛋白的表達(dá)水平及蛋白含量，結(jié)果顯示微波和180℃烘干處理仍能檢測(cè)出Bt蛋白；高溫滅活處理在TT51-1和KF6中能檢測(cè)到極少量的蛋