牛糞高溫堆肥過(guò)程中的物質(zhì)變化、微生物多樣性以及腐熟度評(píng)價(jià)研究.pdf

1、好氧高溫堆肥是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物資源化利用的手段。高溫堆肥過(guò)程中的物質(zhì)變化與腐熟度評(píng)價(jià)以及微生物多樣性的研究一直以來(lái)都是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)，它們與堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量和堆肥發(fā)生的機(jī)理密切相關(guān)，對(duì)堆肥的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。但是，文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)堆肥腐熟度的評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定起來(lái)比較復(fù)雜，不利于中小型堆肥企業(yè)的實(shí)際應(yīng)用。另外，對(duì)于堆肥過(guò)程中微生物多樣性的研究更多的是以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小型發(fā)酵試驗(yàn)為主，而對(duì)于企業(yè)應(yīng)用較多的傳統(tǒng)條垛堆肥發(fā)酵關(guān)注較少

2、，并且分析方法也有一定的缺陷。因此，本文以牛糞和水稻秸稈為原料進(jìn)行了高溫條垛堆肥的發(fā)酵，對(duì)堆肥過(guò)程中的物質(zhì)變化與腐熟度評(píng)價(jià)以及微生物多樣性進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)對(duì)堆肥過(guò)程中的部分物理指標(biāo)、化學(xué)指標(biāo)和生物指標(biāo)的研究表明整個(gè)堆肥過(guò)程可以明顯的分為升溫（0-12天）、高溫（22-52天）和降溫腐熟（62-112天）三個(gè)不同的階段，有機(jī)物質(zhì)的降解和水分的蒸發(fā)等主要發(fā)生在堆肥的升溫和高溫階段(0-52天)，而硝化作

3、用和腐殖化作用主要發(fā)生在堆肥的降溫和腐熟階段。以測(cè)得的各種理化指標(biāo)進(jìn)行腐熟度評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)單個(gè)指標(biāo)并不能很好的評(píng)估堆肥的腐熟程度，必須兩個(gè)或兩個(gè)以上的指標(biāo)相結(jié)合。以發(fā)芽指數(shù)(GI)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)性分析表明C/N、OM損失扣NH4+-N/NO3--N是更為可靠的牛糞堆肥腐熟度的評(píng)價(jià)指標(biāo);各指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)表明以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥62天以后已經(jīng)達(dá)到腐熟。
　　 2.三維熒光光譜與熒光區(qū)域指數(shù)（EEM-FRI）的研究結(jié)果表明在牛糞高溫堆

4、肥過(guò)程中，蛋白質(zhì)的含量逐漸低，而腐殖酸和富里酸的含量則逐漸上升;通過(guò)EEM-FRI與堆肥過(guò)程中的理化指標(biāo)以及生物指標(biāo)的相關(guān)性分析確定，EEM-FRI與大部分常用的評(píng)價(jià)堆肥腐熟度的理化指標(biāo)都顯著相關(guān)，因此可以用于評(píng)價(jià)牛糞堆肥的腐熟度，并且具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。紅外光譜的分析結(jié)果則顯示隨著堆肥的進(jìn)行，不同時(shí)期堆肥樣品的紅外光譜的峰所在的區(qū)域變化不大，只是峰的強(qiáng)度變化較大。
　　 3.分別對(duì)五種不同的堆肥DNA提取方法進(jìn)行了細(xì)胞破壁效

5、率、DNA和腐殖酸產(chǎn)量、PCR擴(kuò)增和微生物多樣性等方面的比較，建立了一種適合以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥樣品的DNA提取和純化方法FTSPP。FTSPP法的細(xì)胞破壁效率達(dá)到了94.6％，純DNA的產(chǎn)量達(dá)到了33.19μg/g dw，并且在1μg/μl牛血清白蛋白(BSA)存在的條件下成功的進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并且通過(guò)熒光定量PCR和DGGE分析表明， FTSPP法提取的DNA獲得的細(xì)菌和放線菌的16S rRNA的拷貝數(shù)以及DGGE條帶數(shù)均

6、高于其他方法。
　　 4.通過(guò)平板培養(yǎng)技術(shù)對(duì)牛糞高溫堆肥過(guò)程中的常溫(30℃)和高溫(55℃)微生物的數(shù)量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明無(wú)論常溫還是高溫可培養(yǎng)微生物的數(shù)量在堆肥過(guò)程中均經(jīng)歷了一個(gè)先增加再降低然后再增加的變化趨勢(shì)，常溫細(xì)菌和放線菌的數(shù)量在第22天達(dá)到最大值，分別為9.331g CFU/g dw和7.181g CFU/g dw，而常溫真菌則在第12天達(dá)到最大值，為5.121g CFU/g dw;高溫細(xì)菌和放線菌數(shù)量最大值出現(xiàn)的

7、時(shí)間比常溫微生物明顯滯后，均在第32天獲得最大值，1g CFU/g dw分別為7.17和5.78，而高溫真菌在第22天達(dá)到最大值，1g CFU/g dw為3.24。
　　 根據(jù)DGGE的研究結(jié)果可將整個(gè)堆肥過(guò)程分為0-12天、22-52天和62-112天三個(gè)與根據(jù)溫度劃分相一致的階段，在堆肥前期（0-12天）微生物種類變化最劇烈，但總體呈現(xiàn)先上升再下降最后再上升的變化趨勢(shì)，并且高溫階段的樣品與降溫腐熟階段的樣品的相似性要高于升溫

8、階段的樣品。成功測(cè)序的DGGE條帶的序列比對(duì)結(jié)果顯示，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidetes，Proteobacteria和Actinobacteria是堆肥過(guò)程中主要的微生物門類，條帶M和條帶X均與Bacillus屬微生物表現(xiàn)出了較高相似性(99％)，條帶S則與Streptomyces sp.(EF012138)表現(xiàn)出了100％的序列相似性，另外，大部分為未培養(yǎng)的微生物。根據(jù)FRI參數(shù)與堆肥過(guò)程中細(xì)菌的種類變化的相關(guān)性分析發(fā)

9、現(xiàn)PⅡ,n和PⅣ,n與堆肥過(guò)程中細(xì)菌的種類變化的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.907和0.949，進(jìn)一步的線性回歸分析證明PⅣ,n是更可靠地評(píng)價(jià)以牛糞和水稻秸稈為原料的堆肥過(guò)程中細(xì)菌種類變化的參數(shù)。
　　 分別對(duì)0、12、42和112天的堆肥樣品進(jìn)行了16S rRNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建和序列分析，成功測(cè)序的779個(gè)克隆的Genebank登陸號(hào)為JQ336994-JQ337772。多樣性分析表明四個(gè)時(shí)間段的Shannon-Wienner指

10、數(shù)分別為2.64、3.25、3.18和4.05。序列分析顯示Frimicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi門的微生物在堆肥過(guò)程中普遍存在，而Actinobacteria則只存在于堆肥的高溫階段（42天），并且第一次在堆肥后期樣品中（112天）發(fā)現(xiàn)了BCR1門的微生物。Arthrobacter屬的克隆數(shù)在高溫階段的樣品中（42天）含量最高，達(dá)到了21.74％;而Bacillus和Ba

11、cillus相關(guān)的屬包括Soilbacillus，Aneurinibacillus，Marinibacillus和Ureibacillus的相對(duì)含量為8.70％，在第112天更是達(dá)到了10.25％;另外，第112天的樣品中，伴隨著新的屬包括Flavobacterium，Parapedobacter，Nitrosomonas，Ochrobactrum和Rhizobium的出現(xiàn);所有文庫(kù)中有相當(dāng)一部分序列屬于未分類微生物，并且隨著堆肥的進(jìn)行

12、它們所占的比例越來(lái)越高。
　　 5.從第82天的新鮮堆肥樣品中經(jīng)過(guò)富集、初篩和復(fù)篩成功的分離到兩株具有較高纖維素酶活的細(xì)菌菌株T1和T2，結(jié)合生理生化和16S rRNA基因序列分析分別鑒定為Bacillus cereus和Bacillus subtilis。根據(jù)NCBI報(bào)道的Bacillus subtilis葡聚糖內(nèi)切酶基因設(shè)計(jì)引物，克隆到Bacillus subtilis T2的葡聚糖內(nèi)切酶基因，與報(bào)道的內(nèi)切酶基因均具有99％