黃山臭鱖魚發(fā)酵過程中微生物多樣性的研究.pdf

1、鱖魚（Mandarinfish）是肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富的名貴食用淡水魚類。傳統(tǒng)臭鱖魚以新鮮鱖魚為原料，配以一定量香辛料，經(jīng)低鹽（5％左右）、低溫(10-14℃)短期腌制而成的發(fā)酵魚產(chǎn)品。臭鱖魚作為傳統(tǒng)徽式風(fēng)味名菜之一，既保持了新鮮鱖魚的本味原汁，又融合了發(fā)酵形成的似臭非臭、香鮮透骨、魚肉酥爛的特點，深受廣大消費者的青睞。本文以黃山臭鱖魚為研究對象，采用表型及基因型分析手段對不同發(fā)酵階段分離獲得的菌株進行了分類和鑒定，并通過DGG

2、E（變性凝膠電泳）分析技術(shù)對發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物菌群變化進行了研究。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)從黃山臭鱖魚樣品中分離獲得60株乳酸菌，進行了形態(tài)學(xué)觀察，初步了解菌株的性質(zhì);根據(jù)生理生化實驗將60株乳酸菌聚為18類，作為分類鑒定的輔助參考;采用HaeⅢ、HhaⅠ、HinfⅠ、TrulⅠ限制性內(nèi)切酶進一步進行16S rDNA序列RFLP分析，再結(jié)合(GTG)5-PCR指紋圖譜分析，挑取典型菌落進行16S rDNA序列分析，結(jié)果表明

3、:分離到的60株乳酸菌歸屬于6個不同的屬，8個不同的種，它們分別為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、格氏乳球菌(Lc.garvieae)、棉籽糖乳球菌（Lc.raffinolactis）、副乳房鏈球菌（Streptococcus parauberis）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei漫游球菌（Vagococcus sp）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）、赫爾曼腸球菌（

4、Enterococcus hermanniensis）。在發(fā)酵初階段分離出的菌株分別屬于6個種，其中優(yōu)勢菌是清酒乳桿菌和副乳房鏈球菌;在發(fā)酵4天以后，清酒乳桿菌成為發(fā)酵的優(yōu)勢乳酸菌，占發(fā)酵后期乳酸菌的92％。
　　(2)從黃山臭鱖魚樣品中分離獲得53株腸道菌，采用AfaⅠ、MspⅠ和HaeⅢ3種限制性內(nèi)切酶進行16S rDNA序列RFLP分析，再結(jié)合ERIC-PCR指紋圖譜分析，挑取典型菌落進行16S rDNA序列分析，結(jié)果表明:

5、53株分離菌株最終被鑒定為3個科、13個屬，包括雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri）、摩氏摩根菌（Morganellaorgani威斯康星米勒氏（Moellerella wisconsensis）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、克雷伯氏屬（Klebsiella sp）、鄉(xiāng)間布丘氏菌（Buttiauxella grestis）、蜂房哈夫尼菌（Hafniaalvei類志賀鄰單胞菌（Plesiomo

6、nas shigelloides）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii腸桿菌（Enterobacter sp.）、抗壞血酸克呂沃爾菌（Kluyvera ascorbata）和路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）14個不同的種。
　　對測序菌株進一步采用API20E試劑條進行鑒定，除瓊氏不動桿菌為發(fā)酵菌株，

7、鑒別率較低，氣單胞菌只能鑒別到屬外，其余菌株的API20E鑒定結(jié)果與分子鑒定結(jié)果完全一致。
　　(3)從臭鱖魚中分離到的耐鹽菌具有較高的多樣性，44株耐鹽菌分別歸屬于9個屬:嗜冷桿菌屬（Psychrobacter spp.）17株、弧菌屬（Vibrio spp.）15株、葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）3株、巨型球菌屬（Macrococcus spp.）3株、大洋單胞菌屬（Oceanimonas spp.）2株

8、、海桿菌屬（Marinobacter sp.）1株、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）1株、短桿菌屬（Brevibacterium sp.）1株、海生乳桿菌屬（Marinilactibacillus sp.）1株。發(fā)酵初始階段，耐鹽菌種類較多，從發(fā)酵4天開始，嗜冷桿菌和弧菌成為優(yōu)勢嗜鹽菌，在發(fā)酵8天臭鱖魚成品中弧菌是唯一的優(yōu)勢耐鹽微生物。
　　(4)以不同發(fā)酵階段臭鱖魚中細菌宏基因組為模版進行了16SrDNA V6-V8

9、可變區(qū)PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)DGGE分析發(fā)現(xiàn)，腸球菌（Enterococcus sp.）、腐敗西瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）和乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）在整個發(fā)酵時期所占比例較大，為臭鱖魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。整個發(fā)酵過程中，腸球菌在各個發(fā)酵時期都保持著較高的豐度;腐敗西瓦氏菌在發(fā)酵2天的樣品中檢出，一直延續(xù)到

10、發(fā)酵結(jié)束，但豐度呈下降趨勢;溶酪大球菌在鮮鱖魚中豐度較高，發(fā)酵第2天未檢測出，發(fā)酵第4天至發(fā)酵結(jié)束，其豐度呈上升趨勢;維氏氣單胞菌（A.veronii）、不可培養(yǎng)氣單胞菌（UnculturedAeromanas sp.）和殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）都屬于氣單胞菌屬，本研究中檢出于鮮魚和發(fā)酵第2天樣品中，隨后消失。熱殺索氏菌（Brochothrix thermosphacta）和依氏假交替單胞菌（Pseudoalterom

11、onas issachenkonii）分別在鮮魚和發(fā)酵4天的樣品中檢出。DGGE分析結(jié)果顯示，臭鱖魚發(fā)酵過程中存在數(shù)量較多的腐敗微生物數(shù)，除腸球菌和溶酪大球菌為發(fā)酵乳、肉制品常見分離菌株外，其余9株均與食品的發(fā)酵過程不甚相關(guān)。
　　綜合以上研究結(jié)果可以看出，臭鱖魚發(fā)酵過程中存在一定數(shù)量的發(fā)酵菌株，這些菌株可以作為發(fā)酵劑用于傳統(tǒng)魚制品的發(fā)酵;但是，臭鱖魚發(fā)酵過程中還存在數(shù)量較多的腐敗菌和致病菌或條件致病菌，這些細菌的存在使臭鱖魚存在