淡水育珠蚌硫氧還蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的分子克隆及表達分析.pdf

1、本實驗采用RACE PCR技術(shù)和巢氏PCR方法分別從褶紋冠蚌和三角帆蚌中克隆到硫氧還蛋白(Trx)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Grp78)基因的cDNA全長序列。通過熒光定量PCR技術(shù)分析了Trx在褶紋冠蚌血細胞、肝胰腺、鰓、外套膜和肌肉組織中的表達，以及PBS刺激和金黃色葡萄球菌刺激后其在褶紋冠蚌五種組織中的表達變化。利用半定量RT-PCR分析Grp78基因在三角帆蚌的五個組織中表達，以及冷、熱休克誘導(dǎo)后Grp78基因在三角帆蚌的五個組織中

2、表達變化。
　　 1、CpTrx基因序列1169 bp（登錄號:KC209545），其中5'非編碼區(qū)(UTR)長11bp，3'非編碼區(qū)長840 bp，含有PolyA尾和典型的腺苷酸信號序列AATAAA，開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）長度為318 bp，編碼105個氨基酸。預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為11.79 kDa，等電點為5.38，不含有信號肽。氨基酸序列中含有1個Thioredoxin結(jié)構(gòu)域(T3-K10

3、4)，區(qū)域內(nèi)包含一個保守的CGPC活化位點。序列同源性比較結(jié)果顯示褶紋冠蚌Trx與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)和紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)的氨基酸序列一致性分別為56％和52％。預(yù)測的Trx空間結(jié)構(gòu)由5個β折疊和4個α-螺旋組成，α-螺旋包圍β折疊形成緊密的球形，這一結(jié)構(gòu)與人的Trx空間結(jié)構(gòu)相似。Trx mRNA在血細胞、肝胰腺、鰓、外套膜、閉殼肌中均有表達，在鰓中表達量最高，其次是

4、肝胰腺。金黃色葡萄球菌刺激褶紋冠蚌后，與PBS相比，各組織中的Trx表達量上升，血細胞中12h達到最高點后逐漸降低，48h最低但仍比空白對照高;肝胰臟中12h到48h一直升高到最大;鰓中12h明顯升高，并達到最大值，然后開始降低直至空白對照以下;外套膜中12h和24h的表達量逐漸降低，36h的表達量升高，達到最大值，48h的表達量再次降低至空白對照以下;閉殼肌中12h明顯升高，并達到最大值，24h、36h、48h的表達量明顯降低并至空白

5、對照以下。
　　 2、HcGrp78基因cDNA全長為3721 bp，其中5'UTR長度為148 bp，3'UTR長度為1578 bp，包含1個AATAA加尾信號和一個多聚腺苷酸ploy(A)尾，開放閱讀框長度為1995 bp，預(yù)測編碼664個氨基酸。預(yù)測HcGrp78蛋白分子量為73.27kDa，理論等電點為4.99。N端有一段長度為22個氨基酸的信號肽(Met-Gla22)。第44-51個氨基酸、第232-245個氨基酸及第

6、369-383個氨基酸為3個HSP70家族的簽名序列(Signature sequence)，分別為IDLGTTYS、VFDLGGGTFDVSLL和VVLVGGSTRIPKVQQ.含有16個絲氨酸磷酸化位點和、8個蘇氨酸磷酸化位點、4個酪氨酸磷酸化位點。序列同源性比較結(jié)果顯示三角帆蚌Grp78與其他物種高度保守，同源性在92％以上。HcGrp78 mRNA在三角帆蚌肌肉、外套膜、鰓、肝胰腺和血細胞中均有表達。4℃冷刺激后，與正常溫度20