基于FISH技術(shù)的秸稈干發(fā)酵中微生物動(dòng)動(dòng)態(tài)變化的研究.pdf

1、沼氣發(fā)酵是有機(jī)物在無氧環(huán)境下經(jīng)微生物分解，將其中一部分碳素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳的生物化學(xué)過程。這一過程涉及多種微生物相互協(xié)調(diào)，聯(lián)合交替，極為復(fù)雜。在不同發(fā)酵階段，微生物的種類、數(shù)量和代謝活性均有變化，各微生物種群的代謝及相互作用直接影響沼氣發(fā)酵的效率。本文研究了秸稈沼氣干發(fā)酵各階段微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及發(fā)酵溫度對(duì)干發(fā)酵過程的影響，探討了微生物群落與基質(zhì)特性之間的關(guān)系，旨在為優(yōu)化秸稈沼氣干發(fā)酵工藝，提高產(chǎn)氣效率提供理論依

2、據(jù)。
　　1.采用物理、化學(xué)以及酶處理的細(xì)胞破壁方法，提取秸稈沼氣干發(fā)酵基質(zhì)中微生物總DNA，對(duì)其純度和得率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：采用凍融處理和酶處理相結(jié)合的破壁處理方法最為有效，DNA純度（A260/A280）和得率分別達(dá)到1.392±0.027和0.143±0.016mg/g；DNA純化試劑盒純化DNA粗提液，比吸附劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）純化的純度提高了34.6％，但A260/A280仍在1.8以下，未能達(dá)到利用PCR分析

3、法對(duì)微生物進(jìn)行定量的要求，因此不能作為本實(shí)驗(yàn)中微生物定量測(cè)定的有效方法。
　　2.優(yōu)化了熒光原位雜交技術(shù)（FISH）定量測(cè)定秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)中微生物的樣品預(yù)處理?xiàng)l件，并在最優(yōu)條件下做了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：使用無水乙醇作為清洗液，F(xiàn)ISH樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度和豐度比用PBS清洗液（磷酸緩沖鹽溶液）時(shí)有顯著提高；樣品預(yù)處理過程中加無菌玻璃珠震蕩能提高微生物的分散度，從而提高FISH技術(shù)對(duì)秸稈厭氧發(fā)酵基質(zhì)中微生物定量的準(zhǔn)確性；采用離心

4、轉(zhuǎn)速為13000r/min時(shí)，微生物菌體收集率提高，而且還能保證完好的細(xì)胞形態(tài)，為后續(xù)的FISH雜交奠定基礎(chǔ)。
　　3.以多聚甲醛固定時(shí)間、熱固定時(shí)間、乙醇脫水時(shí)間、雜交溫度、雜交時(shí)間為試驗(yàn)因素進(jìn)行二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)，對(duì)FISH定量檢測(cè)玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基料中微生物的最佳雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳的雜交試驗(yàn)條件為多聚甲醛固定時(shí)間18h、熱固定時(shí)間15min、乙醇脫水時(shí)間3min、雜交溫度44℃、雜交時(shí)間1.5h。在該

5、試驗(yàn)條件下觀察的熒光顯微圖像菌量最多，熒光信號(hào)最為強(qiáng)烈，且菌體分辨清晰。
　　4.研究了溫度對(duì)玉米秸稈厭氧干發(fā)酵基質(zhì)特性及微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律的影響，探討了基質(zhì)特性與微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明：37℃和55℃條件下沼氣發(fā)酵啟動(dòng)的均較快，乙酸化和甲烷化很快達(dá)到平衡，整個(gè)過程未出現(xiàn)明顯的酸積累，反應(yīng)體系的pH值和堿度變化較平穩(wěn)，pH始終維持在適宜甲烷化菌生長的范圍；20℃下由于甲烷化菌生長代謝緩慢，不能及時(shí)將產(chǎn)生的有機(jī)酸轉(zhuǎn)化

6、成甲烷，造成了一定的酸積累，而過度的酸積累又進(jìn)一步抑制了甲烷化菌的生長繁殖和代謝，導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵過程中CH4含量始終處于較低水平；37℃和55℃下的微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，37℃乙酸甲烷菌數(shù)量變化較明顯，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氫甲烷菌的數(shù)量，而55℃下氫甲烷化菌的數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，說明37℃和55℃下產(chǎn)生甲烷的主要菌群分別是乙酸甲烷菌和氫甲烷化菌；在發(fā)酵前期，各類甲烷化菌的數(shù)量變化不明顯，起主導(dǎo)作用的微生物是產(chǎn)酸型的細(xì)菌，它們將大分子有機(jī)物質(zhì)快速分解成小