應(yīng)用雙特異分子探針技術(shù)對圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）進(jìn)行定性定量檢測研究.pdf

1、對海洋浮游植物進(jìn)行分離、純化、種類鑒定和定性定量檢測是浮游植物研究中最重要的工作之一。對于浮游植物的檢測與鑒定，傳統(tǒng)的研究方法為形態(tài)學(xué)觀察，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，一些先進(jìn)的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到浮游植物檢測中，比如核酸雜交技術(shù)、分子免疫技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及流式細(xì)胞術(shù)，另外HPLC技術(shù)也應(yīng)用到浮游植物檢測中來。目前利用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以直接對單個(gè)浮游植物細(xì)胞進(jìn)行操作。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)是應(yīng)用核酸探針技術(shù)對浮游植物進(jìn)行定性定量分析，特別是原位雜

2、交和三明治雜交在浮游植物檢測中應(yīng)用比較廣泛。 本研究對圓海鏈藻進(jìn)行了DNA的提取與純化、rDNA序列擴(kuò)增、克隆與測序；并基于一種全新的浮游植物檢測技術(shù)——雙特異分子探針技術(shù)，設(shè)計(jì)出一套分子探針；通過對各探針的使用濃度、探針標(biāo)記方法的選擇、酶切溫度對特異性的影響以及樣品與處理方式對檢測信號的影響等實(shí)驗(yàn)條件的探討與優(yōu)化，建立了圓海鏈藻的穩(wěn)定可靠的定性定量檢測方法；通過核酸酶降解實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該技術(shù)中與寡核苷酸探針進(jìn)行雜交的靶物質(zhì)主要是R

3、NA；并進(jìn)行了該方法的探針特異性實(shí)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及模擬樣品的檢測；另外對藻細(xì)胞保存方式對檢測信號的影響以及整個(gè)細(xì)胞生長周期內(nèi)檢測信號的變化進(jìn)行了探討。 研究結(jié)果表明，擴(kuò)增所得到的圓海鏈藻核糖體小亞基基因序列長為1787bp；經(jīng)過特異性驗(yàn)證，證明本研究設(shè)計(jì)的針對圓海鏈藻的雙特異分子探針(抓捕探針、S1探針、連接探針和信號探針)具有很好的特異性，能鑒定到種；對RNase和DNase處理前后的信號值進(jìn)行的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在液相

4、體系中與寡核苷酸探針特異雜交的目的核酸大部分為RNA；樣品預(yù)處理方式對結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞裂解液直接雜交較之提純RNA后雜交方法要快速、簡潔、穩(wěn)定的多，故接下來的實(shí)驗(yàn)中選擇細(xì)胞裂解液直接雜交方法；按照前面所建立的實(shí)驗(yàn)方法建立的圓海鏈藻檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0019x-0.0284，其中x代表目的細(xì)胞數(shù)，y代表信號值，R2=0.995，具有很好的相關(guān)性，并且批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=4)比較小，說明該檢測曲線具有較高的穩(wěn)定性，最低可檢測到

5、88個(gè)目的藻細(xì)胞；模擬樣品檢測實(shí)驗(yàn)表明，用雙特異分子探針技術(shù)檢測結(jié)果與顯微鏡檢測結(jié)果基本一致，并且天然海水中其它浮游生物的存在對該檢測無顯著影響；藻細(xì)胞保存方式對信號值的影響實(shí)驗(yàn)表明，相同的細(xì)胞數(shù)值接進(jìn)行現(xiàn)場檢測時(shí)所得的信號值最高，其次是雜交后保存的樣品，然后是裂解后保存的樣品，信號值最低的是直接保存細(xì)胞；在整個(gè)生長周期中，對數(shù)生長期前期信號值逐漸升高，然后逐漸降低，結(jié)合細(xì)胞的生長率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞的生長率高時(shí)，信號值也高，說明此期間細(xì)