基于EMA-PCR-qPCR的檢疫性有害生物傳病風(fēng)險評估新技術(shù)的建立.pdf

1、柑橘潰瘍病(Xanthomnas citri subsp.citri)是嚴(yán)重危害柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一，列入2007年公布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物》名錄。茄科植物青枯病（Ralstonia solanacearum）寄主范圍廣泛，病原菌在土壤中長期存活，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，常規(guī)PCR技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)因具有較高的特異性、靈敏性等優(yōu)勢已經(jīng)廣泛地運(yùn)用于以上植物病原細(xì)菌的檢測鑒別中。然而傳統(tǒng)的基于DNA

2、為檢測靶標(biāo)的PCR方法，能擴(kuò)增死菌、活菌、活的不可培養(yǎng)菌以及殘存的DNA，因而無法準(zhǔn)確檢測出活菌。而實(shí)踐中很多時候需要區(qū)分死、活細(xì)胞或只需要檢測殘存的活細(xì)胞，比如醫(yī)學(xué)上檢測感染的治療效果、植物檢疫上檢測病原菌除害處理效果、植物病害風(fēng)險評估等，因為只有活細(xì)胞才有危害風(fēng)險存在，因而傳統(tǒng)的基于DNA的PCR檢測方法往往使檢測結(jié)果出現(xiàn)較高的假陽性。同時，植物病原細(xì)菌―活的不可培養(yǎng)的狀態(tài)‖（Viable but Non-Culturable，VB

3、NC）的研究也逐步廣泛并深入，許多重要的植物病原細(xì)菌會在一定條件下進(jìn)入 VBNC狀態(tài)，從而能逃過常規(guī)培養(yǎng)分離法的檢測成為―隱性‖傳染源，導(dǎo)致檢測假陰性結(jié)果,而處于VBNC狀態(tài)的病原菌可能會重新恢復(fù)并重獲致病性而成為初侵染源，導(dǎo)致田間病害發(fā)生與流行。因此迫切需要一種能特異、準(zhǔn)確、快速檢測植物病原細(xì)菌活菌方法。
　　特異性核酸染料疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA），一種能與DNA分子緊密共價結(jié)合

4、的熒光染料。EMA分子進(jìn)入死、活細(xì)胞時有選擇性，僅僅能進(jìn)入細(xì)胞壁和細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞內(nèi)，而活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜系統(tǒng)能阻止EMA分子的進(jìn)入。將EMA染料對死活細(xì)胞的選擇滲透性與現(xiàn)有的PCR分子技術(shù)有效結(jié)合起來，建立一種活菌檢測的快速、靈敏PCR方法，僅以活的微生物的基因組DNA為檢測靶標(biāo)，能克服傳統(tǒng)PCR無法區(qū)分死活菌的弊端，有效降低傳統(tǒng)PCR檢測的假陽性，以及平板計數(shù)法在檢測VBNC狀態(tài)病原菌時帶來的假陰性結(jié)果，使檢測結(jié)果更加科學(xué)、準(zhǔn)確

5、、可靠。首先是在制備PCR擴(kuò)增的DNA模板前經(jīng)EMA滲透預(yù)處理，優(yōu)化出純培養(yǎng)條件下區(qū)分能有效區(qū)分死、活菌的最適EMA濃度以及PCR體系；然后將純培養(yǎng)條件下建立的EMA-PCR檢測體系用于檢測處于VBNC狀態(tài)的病原菌，判斷檢測結(jié)果；最后將該技術(shù)用于帶菌實(shí)際樣品的檢測中；取得的主要研究結(jié)果：
　　①柑橘潰瘍病菌EMA-PCR快速活體檢測技術(shù)的建立：根據(jù)柑橘潰瘍病菌獨(dú)有的保守蛋白基因設(shè)計特異性引物擴(kuò)增出278bp的靶帶，PCR反應(yīng)的檢測

6、下限為25個細(xì)菌/25μL或2.75pg/25μL。EMA-PCR結(jié)果表明：當(dāng)鹵鎢燈曝光時間1min，EMA終濃度為1.0mg/L時，能有效抑制1.0×108CFU/mL死菌的擴(kuò)增；當(dāng)EMA的濃度小于30mg/L時, EMA對上述相同濃度活菌靶基因的擴(kuò)增沒有明顯的抑制。EMA-PCR對死活混合菌的擴(kuò)增表明，活菌數(shù)在6.875×101-6.875×105CFU/PCR范圍時，熒光強(qiáng)度與混合體系中活菌的對數(shù)值有線性關(guān)系（R2=0.934）。

7、基于以上建立的EMA-PCR活體檢測技術(shù)，對重慶、廣西等地采集了共12份疑似柑橘潰瘍病癥狀的葉片和果實(shí)樣品進(jìn)行檢測，與常規(guī)PCR技術(shù)和平板計數(shù)法比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能降低柑橘潰瘍病菌檢測過程中的假陽性。
　?、谇芽魄嗫菥鶨MA-qPCR活菌檢測體系的建立：根據(jù)青枯菌UDP-3-O-acyl-GlcNAc deacetylase基因設(shè)計特異引物RSF/RSR，擴(kuò)增目的片段長度為159 bp。終濃度為2.0mg/L的EMA能有效排除1.0×

8、107CFU/mL滅活青枯菌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，對活細(xì)胞和不可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but Non-Culturable，VBNC）的活菌的DNA擴(kuò)增均沒有影響。當(dāng)活菌濃度≤107CFU/mL和EMA濃度≥40mg/L時，對活細(xì)胞的靶基因擴(kuò)增有顯著的抑制作用（P<0.05）?？梢?，影響活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的EMA濃度（40mg/L）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抑制死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA濃度（1.5mg/L）。當(dāng)每個定量PCR反應(yīng)體系中的活細(xì)胞在5.0×1

9、00-5×104 CFU范圍內(nèi)時，擴(kuò)增Ct值與定量PCR反應(yīng)體系中活細(xì)胞CFU對數(shù)值呈良好的負(fù)相關(guān)性（R2=0.9925）。比較EMA-qPCR法和平板計數(shù)法對經(jīng)過不同溫度短期保存的青枯菌檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，待檢樣品可在24℃與4℃冷藏條件下短期保存。人工接菌模擬土壤帶菌測試表明，土壤直接提取DNA的qPCR擴(kuò)增檢測對土壤中青枯菌的最低檢測限能達(dá)到102CFU/g，且當(dāng)土壤中的菌含量在107CFU/g-102CFU/g范圍內(nèi)，每g土壤所含菌量

10、的對數(shù)值與Ct值有線性關(guān)系（R2=0.995）；去除顆粒的土壤上清液提取DNA的qPCR擴(kuò)增檢測表明，檢出下限比直接提取DNA增加了1個數(shù)量級，為103CFU/g，當(dāng)EMA終濃度為50mg/L，可以抑制106CFU死細(xì)胞/g土壤的DNA擴(kuò)增，在死菌濃度大于106CFU/g時，可以部分抑制死細(xì)胞的擴(kuò)增。
　　本研究探討了EMA-PCR(qPCR)方法在病原菌純培養(yǎng)條件下區(qū)分死細(xì)胞與活的可培養(yǎng)細(xì)胞以及VBNC狀態(tài)細(xì)胞的可能性，優(yōu)化了整