辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子CaWRKY6和CaWRKY30基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、辣椒（Capsicum annuum L.）是我國最主要的蔬菜作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。但辣椒也容易受到各種病原物的危害，近年來由根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）侵染引起的根結(jié)線蟲病已成為辣椒生產(chǎn)中的主要病害之一，由于高抗根結(jié)線蟲品種的缺乏，生產(chǎn)上主要采用一些高毒、高殘留的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，從而導(dǎo)致產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)、生態(tài)環(huán)境的污染和土壤質(zhì)量的退化，成為蔬菜清潔生產(chǎn)中一個亟待解決的突出問題。
　　 本研究主要從分

2、子水平上來探索辣椒與南方根結(jié)線蟲早期親和與不親和互作的機(jī)制，克隆此過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因并進(jìn)行功能分析，以期為辣椒的抗性育種提供新思路。
　　 本研究以含有單顯性抗根結(jié)線蟲基因Me3的辣椒HDA149與南方根結(jié)線蟲親和與不親和互作為基礎(chǔ)，采用新一代Solexa高通量測序技術(shù)，構(gòu)建了辣椒與南方根結(jié)線蟲親和與不親和互作的轉(zhuǎn)錄組cDNA序列數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，利用RACE方法從辣椒與根結(jié)線蟲不親和互作的辣椒根組織中分離出兩個推定的WRK

3、Y轉(zhuǎn)錄因子，并對兩個WRKY基因的分子特征和相關(guān)功能進(jìn)行了研究，實驗獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.鑒定了針對Me3基因不同毒力的南方根結(jié)線蟲（M.incognita）接種辣椒后的表型差異;在此基礎(chǔ)上，建立了辣椒與根結(jié)線蟲親和互作轉(zhuǎn)錄組(SR)cDNA序列數(shù)據(jù)庫和不親和互作轉(zhuǎn)錄組(SR)的cDNA序列數(shù)據(jù)庫，總共獲得了214，909條EST序列，其中HR含190，213條，SR含177，407條;篩選了SR和HR轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)

4、表達(dá)的EST序列，分別為3，615和1，982條，并對其進(jìn)行了功能GO分類;發(fā)現(xiàn)了僅在SR或HR轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)的特異性EST序列，分別為24，696和37，502條，其中具有生物學(xué)分析價值的序列分別為382條和187條，同時對其功能進(jìn)行了GO分類;篩選了部分SR中的EST序列如生長素相關(guān)蛋白、乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子等，HR中如病程相關(guān)蛋白、過氧化物酶基因等進(jìn)行了實時熒光定量RT-PCR驗證;
　　 2.克隆得到了兩個辣椒WRKY轉(zhuǎn)錄因子

5、CaWRKY30和CaWRKY6，CaWRKY30的全長cDNA1533 bp，NCBI GenBank登錄號FJ360844，編碼區(qū)全長1095 bp，編碼推定的364個氨基酸，分子量大小為41.2 kD，等電點6.57;CaWRKY6的全長cDNA1944 bp，編碼區(qū)全長1662 bp，NCBI GenBank登錄號GQ253367，編碼推定的553個氨基酸，分子量大小60.18 kD，等電點6.96;
　　 3.克隆得到

6、了CaWRKY30和CaWRKY6基因編碼區(qū)的基因組DNA序列，CaWRKY30基因編碼區(qū)DNA全長1743 bp，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子;CaWRKY6基因編碼區(qū)DNA全長2530 bp，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子;Southern雜交證實CaWRKY30和CaWRKY6基因在基因組中都以單拷貝的形式存在，是單拷貝基因;
　　 4.CaWRKY30基因受水楊酸(SA)，辣椒疫霉菌、煙草花葉病毒、辣椒青枯菌、非毒性南方根結(jié)線

7、蟲的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，但表達(dá)受到茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制;CaWRKY6基因受辣椒疫霉菌、煙草花葉病毒、辣椒青枯菌、非毒性南方根結(jié)線蟲的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，但受茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制;建立并優(yōu)化了CaWRKY6與CaWRKY30基因的原核表達(dá)系統(tǒng);
　　 5.基因的亞細(xì)胞定位分析表明CaWRKY30和CaWRKY6蛋白都定位于細(xì)胞核，是在細(xì)胞核中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子;
　　 6.構(gòu)建了含有WRKY基因特異性片段的

8、TRV表達(dá)載體，病毒侵染辣椒后RT-PCR驗證WRKY基因的沉默效應(yīng)。CaWRKY30基因沉默的辣椒HDA149植株接種非毒性南方根結(jié)線蟲后，辣椒植株的抗性沒有改變，根結(jié)和卵塊數(shù)量與對照相比差異不顯著，推測這可能與WRKY基因的功能互補(bǔ)、或者沉默不徹底而只需少量轉(zhuǎn)錄本就可正常發(fā)揮功能的特性有關(guān);CaWRKY6基因沉默的辣椒植株則在根結(jié)線蟲侵染后，根結(jié)和卵塊顯著增加，CaWRKY6基因的沉默降低了辣椒對根結(jié)線蟲的抗性。
　　 7.

9、構(gòu)建了CaWRKY30和CaWRKY6基因分別與pCAMBIA2300融合的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法分別導(dǎo)入到了番茄MoneyMaker和煙草植株(Nicotiana tabacum L)中，并分別獲得了CaWRKY30和CaWRKY6基因的轉(zhuǎn)基因T0代植株;轉(zhuǎn)基因超表達(dá)CaWRKY30的番茄和超表達(dá)CaWRKY6基因的煙草對表型沒有任何影響;轉(zhuǎn)基因超表達(dá)CaWRKY30基因的番茄植株對南方根結(jié)線蟲入侵的敏感性增大，植株的