辣椒抗病相關(guān)CaWRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的分離及特性研究.pdf

1、植物在應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫過(guò)程中獲得了一系列復(fù)雜的植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制。這種由于自身進(jìn)化而獲得的防衛(wèi)機(jī)制，主要是通過(guò)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活與轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)生作用的。植物識(shí)別病原物后，通過(guò)一系列信號(hào)傳遞過(guò)程，最終誘導(dǎo)相關(guān)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。在此過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用，它通過(guò)與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，一些轉(zhuǎn)錄因子其自身也是受誘導(dǎo)調(diào)控的，改變特定的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)條件會(huì)使植物的脅迫抗性發(fā)生很大變化。

2、因此，轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。特別是單個(gè)植物防御反應(yīng)基因的超表達(dá)可增強(qiáng)植物對(duì)特定病原物的抵抗能力，而一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的超表達(dá)能夠激活多個(gè)下游抗病基因的表達(dá)。因此，利用防御反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因來(lái)改良植物的綜合抗病性，是一條很有潛力的分子育種途徑。 WRKY蛋白是一種只存在于植物體的新的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其成員廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝以及對(duì)生物或非生物脅迫的反應(yīng)，尤其是在植物抵御病原物侵害的抗病反應(yīng)中具

3、有重要的調(diào)控作用。 本研究以高抗辣椒品種為材料，利用同源克隆法在經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)處理的辣椒葉片中分離到6條CaWRKY基因片段，命名為CapsicumannuumWRKY，即CaWRKY1～6，其中5條為辣椒WRKY新基因。擴(kuò)增得到的6條CaWRKY片段中CaWRKY2片段長(zhǎng)度為659bp，具有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，其它5條片段都在150bp左右，只檢測(cè)到一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)這6條CaWRKY基因進(jìn)行同源與進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其中Ca

4、WRKY1、CaWRKY2、CaWRKY3、CaWRKY4及CaWRKY65條基因的親緣關(guān)系較近，而CaWRKY5與其它基因同源性較低。通過(guò)將6條CaWRKY基因的蛋白翻譯序列與抗病相關(guān)擬南芥第三家族WKRY成員及茄科植物中已分離的WRKY蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)CaWRKY氨基酸序列與擬南芥第三家族的親緣性較低，而與茄科植物的WRKY蛋白親緣關(guān)系接近。其中CaWRKY2、CaWRKY3、CaWRKY4、CaWRKY6與報(bào)道的抗病相

5、關(guān)的煙草WRKY轉(zhuǎn)錄因子如NtWRKY1、NtWRKY2、NtWKRY4親緣關(guān)系非常接近，因此推斷CaWRKY2、3、4、6可能在植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中有相關(guān)作用。 通過(guò)同源進(jìn)化分析，并由于已獲得的長(zhǎng)片段的易操作性，無(wú)論是RACE擴(kuò)增中引物的設(shè)計(jì)還是雜交探針的制備都能提供更多的序列信息，因此本實(shí)驗(yàn)最終確立CaWRKY2為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)基因。對(duì)此基因進(jìn)行RACE，最終獲得部分3'cDNA序列，長(zhǎng)1265bp，編碼290個(gè)氨基酸。對(duì)Ca

6、WRKY23'cDNA序列翻譯后進(jìn)行分析，該WRKY基因的氨基酸序列分別在N端和C端各具一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，因此可推斷該基因?qū)儆赪RKY第一家族成員。 為進(jìn)一步探索該基因在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，以便揭示該基因可能參與的防衛(wèi)信號(hào)途徑。本實(shí)驗(yàn)采用半定量RT-PCR的方法及Northern驗(yàn)證對(duì)CaWRKY2基因的表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探索。結(jié)果表明，CaWRKY2在水楊酸及BABA誘導(dǎo)下表達(dá)量有明顯增高趨

7、勢(shì)，在MeJA誘導(dǎo)下基本不表達(dá)。說(shuō)明CaWRKY2基因可能參與SA信號(hào)途徑。 由于前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)CaWRKY2基因受SA及BABA誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明該基因可能參與相關(guān)的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)，因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證CaWRKY2在生物脅迫下的表達(dá)情況，從而揭示出其相應(yīng)的功能活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)辣椒進(jìn)行了疫霉及線蟲(chóng)侵染實(shí)驗(yàn)，以探究CaWRKY2在辣椒防衛(wèi)反應(yīng)中的作用。經(jīng)Northern雜交驗(yàn)證表明，辣椒疫霉侵染過(guò)程中，CaWRKY2表達(dá)無(wú)明顯變化，而接

8、種二齡根結(jié)線蟲(chóng)后，其表達(dá)量有明顯增強(qiáng)現(xiàn)象，故推測(cè)CaWRKY2在抗疫病反應(yīng)中可能無(wú)特異應(yīng)答作用，而在抗線蟲(chóng)反應(yīng)中可能重要的作用。 綜合上述研究結(jié)果，CaWRKY2在辣椒防衛(wèi)反應(yīng)基因簇的表達(dá)調(diào)控中可能具有重要的作用。辣椒是一種重要的蔬菜作物，辣椒疫病、根結(jié)線蟲(chóng)等生物災(zāi)害是影響我國(guó)辣椒生產(chǎn)的主要障礙，因此，嘗試?yán)肅aWRKY2基因在辣椒中的超表達(dá)來(lái)提高其綜合抗病性，將是一種頗具潛力的分子育種途徑，這對(duì)于揭示辣椒抗病作用分子機(jī)理也具