水稻基因和sRNA表達數量性狀位點研究與調控網絡構建.pdf

1、生物體在時空條件下通過RNA轉錄、蛋白翻譯、代謝物積累、表觀調控等協同作用，維系生物體的平衡，適應多變的生存環(huán)境。在全基因組水平進行表達數量性狀位點研究并構建調控網絡，可以更全面地闡述基因或sRNA等在時空特異條件下的調控模式，探索基因與sRNA在表達調控中的上游調控因子與下游靶標，挖掘基因和sRNA的功能，并揭示它們在維系生物體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用。
　　表達數量性狀位點(eQTL)分析就是把基因或sRNA等在群體中的表達量作為數量

2、性狀（即表達性狀）進行QTL定位，檢測控制RNA表達變異的遺傳位點。不同于傳統的QTL定位，eQTL定位還可以鑒定表達性狀變異的調控模式即順式作用（cis-eQTL）或反式調控（trans-eQTL）。尋找控制表達性狀遺傳變異的trans-eQTL，即鑒定表達性狀的上游調控因子，是eQTL研究的一個重要的任務。同時，一個調控子的表達變異也可能定位到trans-eQTL，被其它因子所調控。這種多個表達性狀和其trans-eQTLs所揭示的

3、調控子和靶標的相互關系便形成一種網狀的結構，為調控網絡的構建提供了最基本的元件。所以整合eQTL和共表達分析可以用來鑒定候選調控子，增加檢測的力度。本研究結果如下:
　　1.發(fā)芽72h苗期樣品eQTL研究
　　我們將珍汕97、明恢63以及由其雜種F1通過單粒傳多代自交獲得的重組自交系(110RILs)浸種催芽，取露白72h后的幼芽，提取RNA，與AffymetrixGeneChipRiceGenomeArray雜交并獲取全基

4、因組探針組信號值。利用601個重組bins的遺傳連鎖圖，和復合區(qū)間作圖方法(CIM)進行全基因組eQTL定位。通過全基因組排列測驗，獲得eQTL定位的LOD閾值3.12(P=0.05)。16，372個e-traits共獲得了26，051個eQTLs。其中4464個是cis-eQTLs，相對于trans-eQTLs，cis-eQTLs具有更大LOD值，并能解釋更多的表達量的變異。
　　eQTL并不是隨機分布在各個染色體上，在第三、第

5、五、第十染色體上出現了明顯的富集，可能存在eQTL熱點。我們以每1cM為區(qū)間，統計每個區(qū)間內eQTL的個數，鑒定了171個潛在的熱點區(qū)，并對這些熱點區(qū)進行GO功能富集分析。在所有可能的熱點區(qū)中，有21個GO類在37個熱點區(qū)中顯著富集。其中GO:0006259（DNA代謝）在5個熱點區(qū)都存在顯著的富集(Chr03:401-402cM、Chr05:717-718cM、Chr10:1205-1206cM、Chr10:1243-1244cM、C

6、hr10:1244-1245cM)。同時結合基因在群體水平的共表達分析鑒定了調控這些DNA代謝相關基因的候選調控子。
　　通過計算所有定位到cis-eQTL的4464個表達性狀與其置信區(qū)間內共定位的trans-eQTLs所對應e-traits的表達相關性，鑒定了99個基因與多于30個具有trans-eQTLs共定位的e-traits顯著共表達。其中有24個基因與100-425個具有trans-eQTLs共定位的e-traits顯著

7、共表達，而這些最顯著的候選調控子并不是轉錄因子，因此非轉錄因子基因也可以在全基因組基因表達調控中發(fā)揮重要的作用。
　　通過比較苗期干重QTL定位的LOD值曲線和eQTL熱點圖譜，發(fā)現傳統表型QTL和eQTL的熱點區(qū)有重疊，而且重疊區(qū)域內大量共定位的eQTLs對應的表達性狀與表型性狀值顯著相關，該表型可能是由大量基因的相互調控導致的。
　　2.水稻見穗期劍葉eQTL的研究
　　本研究利用水稻全基因組芯片獲取珍汕97、明恢

8、63以及其重組自交系群體(210RILs)的見穗期劍葉組織的表達譜，并結合1619個重組bins圖譜定位控制水稻劍葉時期基因表達變異的遺傳因子，即表達數量性狀位點(eQTLs)。了解控制各表達性狀變異的作用模式（cis-eQTL及trans-eQTL），鑒定trans-eQTLs調控熱點，并構建水稻時空特異性的基因表達調控網絡。
　　以探針組在至少三分之一的RILs中表達為篩選閾值，獲得了21，929個具有MSUV6.1注釋的表達

9、性狀（e-traits）。結合1619個重組bins標記構成的高密度圖譜，進行全基因組eQTL定位。10，725個e-traits共獲得13，647個eQTLs，包括37.2％的順式作用的eQTLs，以及62.8％的反式調控的eQTLs。根據物理圖譜和遺傳圖譜的分布，有4條染色體上的eQTL數比期望的要多，可能存在eQTL分布熱點。通過卡方測驗檢測每個bin中實際定位的trans-eQTLs和期望的trans-eQTLs以及超幾何測驗檢

10、測每個bin中觀測到的trans-eQTLs和定位到cis-eQTL的e-traits，共獲得了138個顯著的trans-eQTL熱點bins(P＜0.01)。
　　通過整合見穗期劍葉eQTL對應的e-traits的表達圖譜和基因注釋（功能相關的基因，如GO分類等）以及一種擴展的迭代組合分析方法可以對控制基因表達變異的候選調控子進行篩選。利用參與相同生物學功能的基因進行網絡構建，可以幫助我們分析基因調控的上下游關系，并減少假陽性的

11、產生，有助于提高網絡構建的可行性。通過GO注釋信息與文獻中提到的水稻開花相關基因與穗發(fā)育相關基因的收集，得到177個相關e-traits，共定位到170個trans-eQTLs和109個cis-eQTLs，其中61個cis-eQTLs的置信區(qū)間與至少一個開花相關trans-eQTLs共定位，被定義為group（候選調控子），與cis-eQTL共定位的trans-eQTLs所對應的開花基因為每個group的members，是候選靶標基因。

12、通過計算所有候選調控子和候選靶標的表達相關性，利用iGA（迭代組合分析）的方法，我們鑒定了8個調控子，并根據調控子和靶標基因之間的相互作用情況構建了見穗期開花相關基因的調控網絡。為了確認該網絡的真實性，我們利用珍汕97和珍汕97背景的Ghd7近等基因系NIL(mh7)的見穗期劍葉材料檢測了Ghd7下游靶標的轉錄水平。約80％的統計結果能夠得到實驗的驗證。
　　我們同樣將此策略運用到產量相關的表型QTL。phQTLs和trans-e

13、QTLs熱點的重疊說明定位到熱點區(qū)的trans-eQTLs對應的表達性狀或多或少都會與相應的表型相關。有些直接控制某種農藝性狀，有些則通過作用于某些基因與該性狀相關，而有的則是因為該性狀的產生導致了基因表達的變化，存在一種反饋調節(jié)。
　　3.sRNA在永久F2群體中的表達變異
　　表達數量性狀位點在發(fā)掘控制基因表達水平的遺傳變異位點上已經取得了相當大的進展，可以在全基因組水平鑒定特異的順式、反式調控區(qū)域，構建基因表達調控網絡

14、。eQTL定位的概念也可以擴展到sRNA的表達變異，用來檢測控制群體中sRNA表達變異的遺傳組分。我們利用永久F2群體分析了sRNA在該群體中的表達變異、變異方式和特征，試圖解析調控sRNA表達變異的遺傳調控因子。
　　我們首先構建了SNP替換的親本參考基因組。對所有的雜合材料，同時將reads比對到珍汕97參考基因組和明恢63參考基因組。最后比對的reads將分成三種類型。親本之間保守的sRNAs;在雜合材料中等位特異表達的sR

15、NAs;特異來源于某一親本的sRNAs。0.71％含有SNP位點的sRNAs和17％親本特異表達的sRNA與珍汕97和明恢63的遺傳多態(tài)性相關。
　　sRNA表達性狀在基因組上分布非常廣泛，大量的sRNA表達性狀都集中在基因啟動子區(qū)（基因上游2kb）和基因3'端（基因下游500bp）。24nt的sRNAs在sRNA王國中是最豐富的，充分表現了其序列多態(tài)性，而21nt的sRNA具有更高的表達豐度?？偣灿?63，904個sRNAe-t

16、raits定位到81，096個sQTLs(eQTLsforsRNAe-traits)，其中45，438個sQTLs(56.0％)表現出顯著的顯性效應(P＜0.05，1000permutations)。其中92.3％sQTLs位點呈現出顯著的負向顯性效應，即調控sRNA表達變異的位點在雜合材料中的表達水平比中親值要低。揭示了群體中sRNA表達變異的顯性負調控模式，與中親值相比，更多的sRNA在雜合基因型材料中呈現出下調的趨勢。同時大約96

17、％的具有顯著超顯性效應的sQTLs都是trans-sQTLs。認為在水稻永久F2群體中，負向顯性的trans-sQTLs在sRNA的表達變異中發(fā)揮著主導作用。
　　不同于控制基因表達變異的eQTLs，cis-sQTLs同樣具有熱點，這是由sRNA表達性狀的富集產生的。共獲得了317個cis-sQTLs的熱點bins(p＜0.01)，最顯著的5個熱點區(qū)在第二、第三和第七染色體。同樣有385個bins是trans-sQTLs的熱點區(qū)。

18、最顯著的5個熱點在第四、第五和第九染色體。大多數cis-sQTLs和trans-sQTLs的熱點區(qū)都是不同的。對24nt的sQTL而言，最顯著的trans-sQTL熱點是Bin770(Chr05)和Bin635(Chr04)，而21nt的trans-sQTL熱點是Bin841(Chr06)和Bin449(Chr03)。
　　通過比較OsDCLs、OsAGOs和OsRDRs的eQTLs與trans-sQTL熱點共定位的情況，發(fā)現這些