水稻胚乳非印跡基因的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、水稻是世界性糧食作物之一，產(chǎn)量占世界糧食作物總產(chǎn)30％左右，我國占40％以上。水稻胚乳占糙米重量的90％以上，是人類食用的主要部分。胚乳的發(fā)育狀況直接決定了稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)。有些基因僅在胚乳中表達(dá)，具有器官特異性。這些胚乳特異性基因包括印跡基因和非印跡基因。印跡基因的作用和調(diào)控與種子大小有關(guān)。對于非印跡基因的作用和調(diào)控方式需要研究。
　　Assaf Zemac等對水稻胚乳的測序分析，發(fā)現(xiàn)存在165個(gè)特異表達(dá)基因。本研究根據(jù)Pubm

2、ed網(wǎng)站提供的秈稻和粳稻的SNP上的差異，以這165個(gè)特異表達(dá)的基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選并設(shè)計(jì)了22對非印跡基因的擴(kuò)增引物。以秈稻9311和粳稻日本晴為親本，以正反交后發(fā)育3天和5天的胚乳RNA為研究材料，采用測序方法，確定胚乳特異性的非印跡基因。并在葉片等其它部位進(jìn)一步驗(yàn)證這些非印跡基因的表達(dá)特點(diǎn)。
　　已知胚乳特異印跡基因表達(dá)的調(diào)控方式需要DNA甲基化參與，而非印跡基因的調(diào)控方式仍然未知。推測胚乳特異基因可能存在相同的調(diào)控方式，即DN

3、A甲基化也參與調(diào)控非印跡基因的表達(dá)。為此，對秈稻和粳稻雜交后的種子，在萌發(fā)前期，用藥品5-azacytidine(5-azaC)處理（浸泡），已知這些胚乳特異非印跡基因，在胚中是沉默的，去除DNA甲基化后，這些基因是否能重新在胚中表達(dá)？以處理后萌發(fā)的葉片及其對照的RNA為研究材料，分析非印跡基因的表達(dá)情況是否有改變。具體結(jié)果如下:
　　(1)以雜交授粉5d的胚乳RNA為模板，篩選出4個(gè)胚乳特異性表達(dá)的基因。并證明了其胚乳特異性。針

4、對文獻(xiàn)中報(bào)道的165個(gè)基因，我們根據(jù)注釋，側(cè)重選擇轉(zhuǎn)錄因子，初步篩選18個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)秈稻和粳稻的SNP及引物的限制要求，共確定4個(gè)非印跡基因進(jìn)行驗(yàn)證，作為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)基因。該結(jié)果顯示這四個(gè)基因LOC_Os05g34310.1、LOC_Os07g08420、LOC_Os02g12310.1和LOC_Os01 g24460.1僅在胚乳中表達(dá)，在葉片中沉默。
　　(2)以雜交授粉3d和5d的胚乳RNA為模板做反轉(zhuǎn)錄PCR，結(jié)果表

5、明LOC_Os05g34310.1、LOC_Os07g08420、LOC_Os02g12310.1這三個(gè)基因沒有表現(xiàn)發(fā)育時(shí)間的差異，即不隨著時(shí)間發(fā)生表達(dá)的變化。LOC_Os01g24460.1表現(xiàn)出時(shí)間特異性，即在發(fā)育3d的胚乳中，表現(xiàn)出對雙峰中胸腺嘧啶的完全抑制，表現(xiàn)印跡基因的特征。在5d的胚乳中，則正常表達(dá)。
　　(3)初步證實(shí)了DNA甲基化參與了水稻胚乳非印跡基因的調(diào)控。DNA甲基化可能對部分非印跡特異基因進(jìn)行調(diào)控。用去甲基

6、化試劑5-azaC處理日本晴與9311的雜交成熟種子之后，發(fā)現(xiàn)水稻發(fā)生矮化、發(fā)芽延遲的現(xiàn)象。反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)表明只有LOC_Os07g08420和LOC_Os02g12310.1經(jīng)5-azaC處理之后其在葉片中表達(dá)了，并且表現(xiàn)出對雙峰中胸腺嘧啶的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)5-azaC處理3d-9d的方案中，種子的萌發(fā)率普遍很低。選擇處理NIP×9311、9311×NIP雜交種子，處理3d和5d后萌發(fā)植株的葉片RNA，檢測了4個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)變化，

7、發(fā)現(xiàn)LOC_Os07g08420和LOC_Os02g12310.1基因的表達(dá)被激活，表明其在胚乳中的特異表達(dá)與DNA甲基化有關(guān);而LOC_Os05g34310.1、LOC_Os01g24460.1在葉片中仍然保持沉默，說明其在胚中的沉默可能與DNA甲基化調(diào)控?zé)o關(guān)。
　　(4)同一基因在不同材料中的多樣性。部分基因的激活表達(dá)具有材料特異性。用5-azaC處理粳稻巴利拉與秈稻9311的雜交種子，處理3d。處理后在葉片中只有LOC_Os

8、02g12310.1表現(xiàn)出雙峰中胸腺嘧啶的抑制，LOC_Os07g08420無明顯變化。LOC_Os07g08420基因在日本晴×9311中表現(xiàn)出了對胸腺嘧啶的抑制，該基因可能因?yàn)椴牧系牟煌憩F(xiàn)不同。
　　綜上，本研究結(jié)果說明胚乳中非印跡基因的表達(dá)方式和印跡基因的表達(dá)方式一樣，是多樣化的。既有表觀遺傳的DNA甲基化調(diào)控方式的參與，也有其他未知方式的參與。并且這些基因的表達(dá)同時(shí)還受材料和發(fā)育時(shí)期的影響，因此是一個(gè)比較復(fù)雜的調(diào)控。本