豬場(chǎng)廢棄物堆肥中芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展一方面提高了人民生活水平，另一方面，養(yǎng)豬場(chǎng)糞便的大量集中排放給環(huán)境造成了巨大壓力。目前，尋找具有良好環(huán)境效應(yīng)的畜禽場(chǎng)廢棄物無害化、資源化技術(shù)成為我國(guó)畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)面臨的一項(xiàng)重要課題。堆肥技術(shù)通常用于有機(jī)固體廢棄物的資源化利用，成功的堆肥可以實(shí)現(xiàn)無害化、減量化和資源化的處理目標(biāo)。因此，堆肥被認(rèn)為是養(yǎng)豬業(yè)與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展的有效途徑之一，對(duì)堆肥過程中微生物多樣性的探討是近幾年來的研究熱點(diǎn)。
　　 本課題組在前期的

2、研究中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬和梭菌屬是豬場(chǎng)廢棄物堆肥過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，本研究將PCR-DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)分離方法相結(jié)合，進(jìn)一步在種和屬的水平上對(duì)芽孢桿菌屬和梭菌屬在堆肥過程中的動(dòng)態(tài)變化、種群結(jié)構(gòu)和多樣性差異進(jìn)行了研究;利用FISH技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了原位空間分布研究及快速定量分析;采用生理生化鑒定與16SrRNA序列分析技術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行了特異性菌種鑒定。具體結(jié)果如下:
　　 1.堆肥試驗(yàn)
　　 利用強(qiáng)制通風(fēng)靜態(tài)倉堆肥系統(tǒng)進(jìn)行

3、了堆肥試驗(yàn)，以豬糞為主料，木屑為調(diào)理劑，物料的初始碳氮比(C/N)調(diào)整為20％，初始含水率為60％。堆體溫度的變化過程經(jīng)歷了典型的升溫期、高溫期、降溫期三個(gè)階段，堆體中層溫度在5天時(shí)達(dá)到了60℃，且在50℃以上的時(shí)間持續(xù)了30天，高于55℃以上持續(xù)了25天。整個(gè)堆肥過程歷時(shí)42d。堆制結(jié)束時(shí)，堆體體積減少了42.68％，大腸桿菌值和蛔蟲卵殺滅率分別為0.069和100％，達(dá)到了《糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB7959-87)》的規(guī)定。本次堆肥

4、試驗(yàn)取得成功，為后續(xù)各項(xiàng)研究工作奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.核酸的提取
　　 參照Zhou等(1996)的方法，對(duì)豬糞堆肥樣品中DNA提取方法進(jìn)行了改良，從堆肥過程中升溫期、高溫期、降溫期上、中、下共9個(gè)樣品中提取了基因組DNA，并用試劑盒對(duì)其進(jìn)行了純化。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段大小均在2kbp以上。使用DNA/RNA濃度測(cè)定儀，測(cè)得純化后的DNA濃度為370ng/μl，其A260/A280的比值為1.766。結(jié)果表明，

5、采用改良后的該方法提取、并用試劑盒純化后獲得的核酸結(jié)果較好，能滿足后面分子生物學(xué)研究的需要。
　　 3.芽孢桿菌屬細(xì)菌的分離及鑒定
　　 (1)采用傳統(tǒng)平板稀釋法從豬糞堆肥過程中不同時(shí)期、不同高度層堆肥樣品中分離得到了540株芽孢桿菌，利用HinfⅠ，HaeⅢ和MspⅠ三種限制性內(nèi)切酶對(duì)這些芽孢桿菌進(jìn)行了RFLP分型，得到8種不同的芽孢桿菌，輔以生理生化鑒定試驗(yàn)，并依據(jù)16SrRNA序列分析對(duì)這些菌株進(jìn)行了鑒定，初步得出

6、豬場(chǎng)廢棄物堆肥過程中可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌的多樣性信息。它們分別是Bacillussubtilis，Bacillusmegaterium,Bacillusanthracis,Bacillusthuringiensis,Bacilluscereus,Bacilluspycnu,Bacillusoleronius和Bacilluscirculans。
　　 (2)獲得了8株不同芽孢桿菌的16SrDNA序列，并提交到了GenBank數(shù)

7、據(jù)庫，獲得了登錄號(hào):JF833086-JF833093。
　　 4.可培養(yǎng)的芽孢桿菌的時(shí)空分布
　　 RFLP分析結(jié)果顯示豬糞堆肥過程中，可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌存在著豐富的多樣性和明顯的時(shí)空分布特性。Bacillussubtilis是整個(gè)堆肥過程中的優(yōu)勢(shì)菌;升溫期和降溫期樣品中優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌還分別包括Bacillusanthracis，Bacilluscereus和Bacilluscirculans。升溫期和降溫期中層樣品

8、中的可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌的多樣性相對(duì)更豐富，包括5種不同的芽孢桿菌。多樣性最低的是升溫期下層和高溫期上層和中層樣品。
　　 5.PCR-DGGE分析
　　 (1)PCR-DGGE分析結(jié)果顯示，豬糞堆肥過程中不同時(shí)期、不同高度層堆肥樣品中有著豐富的芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌多樣性，PCR-DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)性條帶都達(dá)到了9條以上，其中高溫期樣品中芽孢桿菌屬細(xì)菌的多樣性相對(duì)更豐富;同時(shí)存在明顯的芽孢桿菌屬種群結(jié)構(gòu)變化，而梭菌屬

9、種群結(jié)構(gòu)變化不明顯，這些都表明豬糞堆肥過程中存在寶貴的芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌資源。
　　 (2)根據(jù)指紋圖譜聚類分析和Cs值分析結(jié)果顯示，處于同一堆肥階段的三個(gè)不同高度層樣品之間的芽孢桿菌屬種群的相似性最高，說明處于同一階段的各高度層樣品的芽孢桿菌屬細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)最接近;9個(gè)堆肥樣品彼此間梭菌屬種群的相似性都很高，說明各樣品之間梭菌屬細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)很接近。9個(gè)堆肥樣品之間的兩屬細(xì)菌的Cs值都沒有明顯的變化規(guī)律，說明堆肥過程中芽孢桿菌

10、屬和梭菌屬細(xì)菌的演替規(guī)律復(fù)雜，更替過程更復(fù)雜，需要我們進(jìn)行更深入的探討。
　　 (3)對(duì)芽孢桿菌屬和梭菌屬DGGE圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行了回收和測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堆肥過程中大部分都是未能培養(yǎng)的芽孢桿菌，并得到了利用純培養(yǎng)方法未能分離到的芽孢桿菌屬細(xì)菌信息，它們包括:Bacilluscereus，Bacillusmarisflavi，Bacilluskoreensis和Bacillusfordii，而Bacilluscereus也是豬糞

11、堆肥過程中的優(yōu)勢(shì)菌，存在于整個(gè)堆肥過程中。堆肥過程中都是未能培養(yǎng)的梭菌，未檢測(cè)到可培養(yǎng)的梭菌。說明PCR-DGGE在分子生態(tài)學(xué)方面具有更大的優(yōu)越性，可以獲得更多的微生物信息。
　　 6.FISH分析
　　 (1)對(duì)芽孢桿菌屬特異性探針LGC353b和梭菌屬特異性探針Chis150的雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化。探針LGC353b和Chis150的最佳雜交溫度都是46℃;最佳雜交時(shí)間分別為4h和5.5h;雜交液中最佳甲酰胺濃度分別為

12、20％和35％。
　　 (2)FISH分析結(jié)果顯示，豬糞堆肥過程中不同時(shí)期、不同高度層堆肥樣品中總細(xì)菌、芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌數(shù)目有著明顯的動(dòng)態(tài)變化和的時(shí)空分布特征。三者的FISH檢測(cè)數(shù)量級(jí)都達(dá)到了106個(gè)/克（濕重）的數(shù)量級(jí)?？偧?xì)菌、芽孢桿菌屬、梭菌屬的時(shí)間分布特征是細(xì)菌總數(shù)隨著溫度的升高而增加，隨著溫度的下降而減少;空間分布特征是處于同一堆肥階段的三個(gè)不同高度層中，中層樣品中芽孢桿菌屬細(xì)菌數(shù)目和其占總細(xì)菌數(shù)的百分比是最低的;