豬弓形蟲體內誘導抗原對NF-kB信號通路的影響.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是由法國學者于1908年發(fā)現(xiàn)的能廣泛寄生于包括人在內的所有溫血動物有核細胞內的一種寄生蟲，它能引起嚴重的人畜共患弓形蟲病。人類對弓形蟲具有較強的自然免疫能力，免疫功能正常的成年人感染后多呈隱形感染，但是對于一些免疫功能受損、免疫缺陷者或者先天性弓形蟲感染者，往往會造成嚴重的后果，因而弓形蟲病的有效防治是極為重要的。弓形蟲生活史復雜，包括組織包囊、卵囊、配子體、速殖子和緩殖子等眾多發(fā)育形式，

2、此外在長期的寄生生活中，弓形蟲發(fā)展出很多的免疫逃避機制以逃避宿主的免疫攻擊。而弓形蟲在入侵的過程中，體內誘導抗原會在宿主內大量表達，推測可能是宿主的免疫系統(tǒng)釋放了免疫因子刺激其體內誘導抗原的表達。
　　哺乳動物轉錄因子NF-κB家族是B細胞中κB輕鏈的調控原件，也是動物主動免疫過程中關鍵性的調控因子。NF-κB家族的轉錄調控與炎性反應、細胞凋亡、細胞增殖、分化以及存活都有著一定關聯(lián)，同時NF-κB信號通路還是宿主免疫系統(tǒng)調控的重要

3、手段。
　　因此體內誘導抗原與NF-κB信號通路極可能有潛在的相互作用。本研究首先將實驗室之前的同學已經篩選獲得的豬弓形蟲體內誘導抗原陽性結果中的部分抗原基因進行體內外表達差異的驗證，PCR擴增基因全長的ORF;然后利用雙熒光素酶檢測方法檢測了這些抗原對NF-κB信號通路的激活效應，并在TNF-α刺激下檢測了它們對該信號通路的抑制效應。具體工作包括以下幾個方面:
　　(1)豬弓形蟲體內誘導抗原體內外表達差異的驗證及全長ORF

4、的PCR擴增
　　選擇本實驗室之前的同學篩選得到的14個豬弓形蟲體內誘導抗原陽性克隆中的5個功能蛋白，即亮氨酸重復序列(LRL)、鈣調蛋白(CaM)、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(D3)、致密顆粒蛋白5(GRA5)、致密顆粒蛋白15(GRA15)，同時包括3個未知功能的假定蛋白，TOX.DB上的編號分別為TGGT1-098800（暫稱G1）、TGME49-212160(M4)、TGGT1-059670(JK)，根據(jù)各自的ORF設計引物

5、，real-timePCR檢測感染弓形蟲速殖子72個小時的BALB/c鼠中的蟲子和BHK細胞中培養(yǎng)相同時長的弓形蟲速殖子中這8個基因mRNA相對表達水平的差異。結果顯示，BALB/c鼠體內速殖子內這8個基因中有6個的表達量都顯著高于體外BHK中的表達量，統(tǒng)計學分析差異顯著(P＜0.05)。另外LRL和M4體內外表達差異并不明顯。利用數(shù)據(jù)庫中的基因全長CDS序列設計了真核表達引物，分別克隆這6個基因的ORF片段，連接真核表達載體pCMV-

6、tag2B，構建了帶Flag標簽的真核表達質粒。
　　(2)豬弓形蟲體內外表達差異抗原對NF-κB信號通路激活效應的影響
　　利用雙熒光素酶檢測方法，驗證體內誘導抗原對NF-κB信號通路的影響。利用已經構建好的NF-κB轉錄的調控元件(啟動子或3'UTR)克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構建熒光素酶報告質粒，使之作為受調控的報告基因，再將海腎熒光素酶基因作為內對照，在細胞中同時轉染以上兩種質粒，檢測NF-κB信號通路的激活。

7、以報道過的弓形蟲ME49株(typeⅡ型)的GRA15作為陽性對照，結果顯示，體內誘導抗原RH株(typeⅠ型)GRA15有顯著的激活NF-κB信號通路的效應。但是隨后的NF-κB原件p65的核轉移實驗未能成功驗證這一結果。
　　(3)豬弓形蟲體內外表達差異抗原對NF-κB信號通路抑制效應的影響
　　同樣利用雙熒光素酶檢測方法，以NF-κB信號通路的刺激物TNF-α的添加作為激活組，在同樣的刺激劑量和時間作用下，觀察載體組和

8、體內誘導基因組對NF-κB信號通路抑制效應的影響。通過多次重復實驗，相比較載體組均未發(fā)現(xiàn)這些基因有抑制NF-κB信號通路的作用。
　　(4)致密顆粒蛋白GRA15(Ⅰ/Ⅱ)免疫原性的研究
　　typeⅠ型和Ⅱ型的GRA15都和免疫相關的NF-κB信號通路有一定關聯(lián)，我們利用小鼠模型求證了這兩個都能激活NF-κB信號通路的基因在BALB/c鼠體內誘導免疫應答的能力。三次免疫后檢測了弓形蟲全蟲裂解抗原刺激抗體產生水平、淋巴細胞增