紅鰭東方鲀4個(gè)免疫基因的原核表達(dá)及群體EST-SSRs分析.pdf

1、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)的肉質(zhì)鮮美,食用價(jià)值高,深受人們的歡迎。紅鰭東方鲀的肝臟和生殖腺等內(nèi)臟可產(chǎn)生河豚毒素,具有很高的活性和特異性,所以在醫(yī)藥開發(fā)方面具有潛在的價(jià)值,在臨床上其應(yīng)用前景較為廣闊。但與常規(guī)養(yǎng)殖魚類相比,紅鰭東方鲀的生物學(xué)特性比較復(fù)雜、特殊,所以比較容易受到外界環(huán)境因子的影響,故疾病發(fā)生率較高。在病原侵襲機(jī)體時(shí),免疫系統(tǒng)起著重要的作用,其主要由免疫細(xì)胞,免疫器官和免疫分子(如白細(xì)胞介素)組成。白細(xì)胞

2、介素7(IL-7)、IL-15、IL-15L和干擾素調(diào)節(jié)因子2(IRF2)是魚類免疫系統(tǒng)中較為重要的免疫分子。
　　(1)本論文利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)從紅鰭東方鲀頭腎組織中克隆出了干擾素調(diào)節(jié)因子2(IRF2),全長(zhǎng)cDNA為1552bp,其ORF為936bp,編碼311個(gè)(aa)氨基酸,推導(dǎo)的氨基酸分子量為35.5kDa,等電點(diǎn)為6.56。其中5’非編碼區(qū)為187bp,3’非編碼區(qū)為429bp。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn),紅鰭

3、東方鲀IRF2可能為親水蛋白,無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),具有DNA結(jié)合域(DBD)、IRF結(jié)合域2(IAD2)和轉(zhuǎn)錄抑制域(TRD)。與其他物種同源性分析發(fā)現(xiàn),紅鰭東方鲀IRF2與鱖魚(S.chuatsi)的相似度最高,達(dá)79％,這些為以后對(duì)此基因功能機(jī)制的了解以及深入探討提供了基礎(chǔ)。
　　(2)根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已發(fā)表的紅鰭東方鲀IL-7、IL-15、IL-15L基因和克隆的IRF2基因,設(shè)計(jì)并合成了用于原核表達(dá)的特異性引物,利用PC

4、R技術(shù)克隆其成熟肽或編碼區(qū)的核苷酸序列,并成功構(gòu)建了pET32a-IL-7、pET32a-IL-15、pET32a-IL-15L、pET32a-IRF2和pET28a-IL-7重組質(zhì)粒,并分別在BL21(DE3)和Rosetta(DE3)細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá),得到了相應(yīng)的融合蛋白。另外,通過優(yōu)化表達(dá)條件找到了各個(gè)基因表達(dá)的最佳菌株、IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)溫度的等條件,為進(jìn)一步表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)提供了技術(shù)支持和便利。純化出的目的蛋

5、白為后續(xù)的生物活性測(cè)定和免疫疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　(3)從NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫下載紅鰭東方鲀的基因組序列和EST序列,然后用SSR-Hunter軟件查找微衛(wèi)星核心序列,利用35個(gè)EST-SSR基因位點(diǎn)的特性對(duì)57個(gè)紅鰭東方鲀個(gè)體樣本進(jìn)行研究。結(jié)果表明,每個(gè)基因位點(diǎn)有2~7個(gè)等位基因數(shù),有效等位基因的平均值為3.3675。觀測(cè)雜合度范圍為0.2281~0.7368,平均值為0.4924,而期望雜合度在0.4986~0.8235

6、之間,平均值為0.6859。多態(tài)信息含量(PIC)在0.3712~0.7904之間,平均值為0.6264。Hardy-weinberg(HWE)平衡結(jié)果顯示,31個(gè)位點(diǎn)有15個(gè)處于平衡狀態(tài)(P>0.01),16個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了不同程度的偏離。導(dǎo)致了微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離平衡的原因可能是養(yǎng)殖群體的個(gè)體之間有一定的親緣關(guān)系。
　　(4)對(duì)紅鰭東方鲀微衛(wèi)星標(biāo)記與體長(zhǎng)、體高和體重生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析,并對(duì)紅鰭東方鲀微衛(wèi)星JX448611、JX4