棉鈴優(yōu)勢表達基因GhMAKR3對棉鈴發(fā)育的影響.pdf

1、棉花是世界上最主要的天然纖維作物，棉花生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位。纖維產(chǎn)量主要由單位面積鈴數(shù)、平均鈴重和衣分三部分組成。產(chǎn)量的增加離不開各組分之間的相互協(xié)調(diào)，這三個組分均與棉鈴發(fā)育密切相關。因此，研究與棉鈴生長發(fā)育相關的基因，進而利用基因工程技術促進棉鈴的生長發(fā)育，可為提高棉花產(chǎn)量和改良纖維品質(zhì)提供新途徑。
　　MAKRs（Membrane Associated Kinase Regulators）蛋白是一類具有激酶調(diào)

2、節(jié)元件的膜結(jié)合蛋白，可能參與調(diào)控不同的信號傳導途徑。擬南芥中AtMAKR1與AtBKI1類似，負調(diào)控BRs信號傳導；AtMAKR4作用在IBA-IAA轉(zhuǎn)化通路下游，促進擬南芥?zhèn)雀男纬?。但是，MAKRs在植物生長發(fā)育中的功能尚不清楚，相關研究報導很少，其對棉花生長發(fā)育的影響更不清楚。
　　本研究從棉花中克隆得到一個具有棉鈴優(yōu)勢表達特性的基因GhMAKR3。為研究GhMAKR3基因的生物學功能，對該基因在棉花中的表達模式及其上游序列

3、的啟動子特性進行了分析；構(gòu)建了S7啟動子調(diào)控的GhMAKR3表達上調(diào)的植物表達載體和CaMV35S啟動子調(diào)控的GhMAKR3表達下調(diào)的植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的棉花遺傳轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因材料；觀察了上調(diào)和下調(diào)該基因表達的轉(zhuǎn)基因棉花的表型。主要結(jié)果如下：
　　1.棉花GhMAKR3基因的克隆與表達模式分析
　　根據(jù)葡萄果實中的EST序列在棉花中克隆得到一個棉鈴優(yōu)勢表達基因，該基因與擬南芥MAKRs家族的AtMAKR3相似性較

4、高（95％），定名為GhMAKR3。序列分析顯示，該基因全長1715bp，包含一個長為1035bp完整的ORF（Open Reading Frame），編碼344個氨基酸殘基。同源性分析顯示，GhMAKR3氨基酸序列與橙子、葡萄、蘋果、蓮、梅花等物種的MAKRs蛋白具有較高的相似性。系統(tǒng)進化樹分析得出，GhMAKR3與可可的未知蛋白、橙子的CsMAKR4-like、梅花的PmMAKR4、蘋果的MdMAKR4有較近的親緣關系。
　　

5、qRT-PCR分析GhMAKR3基因在棉花中的表達特性，結(jié)果顯示該基因在胚珠、纖維、鈴殼的相對表達水平較高，而在棉花的其他組織中表達水平相對較低。進一步分析GhMAKR3基因在不同時期的胚珠、纖維、鈴殼中的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在胚珠發(fā)育的前期（0-10DPA，Days Post Anthesis）表達水平較高，并且在6 DPA時達到最大值；同時在纖維發(fā)育的起始期和快速伸長期（0-12DPA）表達水平較高，并且在7 DPA時達到最大值。在鈴殼

6、發(fā)育的前期（1-4DPA）該基因也有較高的表達水平，且在1DPA時達到最大值。
　　2.GhMAKR3基因上游啟動子調(diào)控元件分析及GUS表達特性
　　運用PlantCare和PLACE數(shù)據(jù)庫分析得出，GhMAKR3基因啟動子序列包括多種順式作用元件，除常見的啟動區(qū)、增強區(qū)順式作用元件外，還包含如胚乳、花粉、根等組織特異表達相關元件，生長素、赤霉素、油菜素固醇等激素響應元件，以及光、熱、干旱等環(huán)境相關的響應元件。這說明GhMA

7、KR3基因的表達受到多種因素的影響。將該啟動子序列與GUS報告基因融合，pGhMAKR3::GUS轉(zhuǎn)基因棉花組織器官中的GUS染色發(fā)現(xiàn)，在花瓣、雄蕊和不同發(fā)育時期的棉鈴中GUS活性較高，在葉片、葉柄、雌蕊部位GUS活性較低。這與該基因在棉花中的表達模式基本相符。
　　3.GhMAKR3基因?qū)Rs信號傳導途徑相關基因表達的影響
　　胚珠離體培養(yǎng)條件下，添加BRZ（Brassinazole，BR合成的特異抑制劑）棉花0DPA胚

8、珠的GhMAKR3表達水平上升，而添加BL（Brassinolide,蕓苔素內(nèi)酯）該基因表達水平下降，這表明該基因的表達受到BRs的抑制。qRT-PCR分別檢測超量和抑制GhMAKR3表達的轉(zhuǎn)基因棉花中BRs信號傳導途徑相關基因的表達水平。上調(diào)GhMAKR3表達，BRs信號傳導途徑上游基因GhBRI1表達水平略有上升，GhBKI1表達水平無明顯變化；該途徑下游基因GhBSU1和GhBIN2表達水平上調(diào)，而GhBZR1表達水平下降。下調(diào)G

9、hMAKR3表達，GhBRI1表達水平下降，GhBKI1表達水平上升；而GhBSU1和GhBIN2表達水平下降，GhBZR1表達水平上升。這表明GhMAKR3基因表達影響B(tài)Rs信號傳導途徑相關基因的表達，可能參與BRs信號傳導過程。
　　4.GhMAKR3基因?qū)w維發(fā)育相關的MYB轉(zhuǎn)錄因子表達的影響
　　qRT-PCR分別檢測超量和抑制GhMAKR3表達的轉(zhuǎn)基因棉花中與纖維發(fā)育相關的MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達變化。上調(diào)GhMAKR

10、3表達后GhMYB25-like、GhMYB25、GhMYB109等基因表達水平降低，且開花當天胚珠表皮纖維細胞起始密度低于同時期的野生型。下調(diào)GhMAKR3表達后除GhMYB109表達水平上升外，GhMYB25-like、GhMYB25表達水平無明顯變化，同時開花當天胚珠表皮纖維細胞起始密度無明顯變化。
　　5.下調(diào)GhMAKR3基因可促進糖向種子的轉(zhuǎn)運
　　上調(diào)GhMAKR3基因表達后，成熟種子可溶性總糖含量變化不明顯，

11、而蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因GhSUT1-9表達水平不同程度降低；下調(diào)GhMAKR3基因表達后成熟種子可溶性總糖含量較野生型提高，同時GhSUT1-9表達水平有不同程度的上升。表明抑制GhMAKR3的表達可以促進糖向種子的轉(zhuǎn)運。
　　6.下調(diào)GhMAKR3基因促進了棉鈴及種子的發(fā)育
　　觀察10DPA棉鈴發(fā)現(xiàn)，超量表達GhMAKR3基因后棉鈴與苞葉均比同時期野生型變小，而干擾該基因表達后棉鈴與苞葉均變大?？挤N和纖維檢測分析得出，上調(diào)G