第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化

1、第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化,基因工程藥物的分離、純化非常重要。表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì) 。它的制得具有以下 特點(diǎn)：①表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；,,②含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；③表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；④表達(dá)產(chǎn)物的種類(lèi)繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；⑤對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。,一、建立分離純化工藝的根據(jù),⒈含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn) 基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：

2、　?、倬N的類(lèi)型及其代謝特性。　?、谠牧吓囵B(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。　?、凵a(chǎn)工藝及條件。,,⒉物料中雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)。　　?、衬康漠a(chǎn)物特性。　　?、串a(chǎn)品質(zhì)量的要求,二 、分離純化的基本過(guò)程,發(fā)酵液 細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物 細(xì)胞破碎 固液分離 濃縮 初步分離 高度純化 制劑 產(chǎn)品包含體

3、 細(xì)胞碎片分離 變性 復(fù)性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,三、分離純化的技術(shù),分離純化的技術(shù)要求：①技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。②選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達(dá)到較高的純化倍數(shù)。,,③收率要高。④兩個(gè)技數(shù)間能直接銜接， 不需要對(duì)物料加以處理。⑤純化過(guò)程要快，滿足高 生產(chǎn)率的要求。,,⒈細(xì)胞破碎與固液分離 ⑴細(xì)胞收集： 離心法、膜分離法。 ⑵細(xì)胞破碎：

4、機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法。 ⑶固液分離,⒉目的產(chǎn)物的分離純化,目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。,,產(chǎn) 物 特 性 　　作 用,,,,,等電點(diǎn) 　決定離子交換種類(lèi)及條件　相對(duì)分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)　疏水性

5、 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度　生物特異性 決定親和配基　溶解性 決定分離體系及蛋白濃度　穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時(shí)間,,⒉目的產(chǎn)物的分離純化,目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來(lái)決定。,,產(chǎn) 物 特 性

6、 　作 用 等電點(diǎn) 決定離子交換種類(lèi)及條件　相對(duì)分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)　疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度　生物特異性 決定親和配基　溶解性 決定分離體系及蛋白濃度　穩(wěn)定性 決定工藝采用溫

7、度及流程時(shí)間,,,,,,產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用,分離純化的方法依賴色譜分離方法,⑴離子交換層析（ ion exchange chromatography IEC） 離子交換層析的基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。,⑵反相色譜（reversed phase chromatography，RPC）和

8、 疏水色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）,反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化的。 反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團(tuán)與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團(tuán)與流動(dòng)相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進(jìn)行分離的。,,常用固定相為硅膠烷基鍵合相。 流動(dòng)相為低離子強(qiáng)度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。

9、由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來(lái)。,,疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。 固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。 流動(dòng)相為pH6～8鹽水溶液。,,在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸

10、附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來(lái)，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。 與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。,⑶親和層析（affinity chromatography，AC）,親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。,,配基：在親和層析中起可逆性結(jié) 合的特異性物質(zhì)。 載體：與配基結(jié)合的支撐

11、物。 親和層析大體可分三步：　　　①配基固定化　　?、谖侥康奈铩　　、蹣悠方馕?⑷凝膠過(guò)濾,凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開(kāi)。,,根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過(guò)濾來(lái)分離純化目的蛋白。 主要應(yīng)用兩個(gè)方面： ①脫鹽和更換緩沖液 ②蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離?！≡诋a(chǎn)品

12、的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。,⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除,DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法：⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離

13、子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除 層析或過(guò)濾可將病毒去除。,⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除,DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。,,⑵熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)

14、中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除 層析或過(guò)濾可將病毒去除。,四、選擇分離純化方法的依據(jù),⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。,,產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式,它可以避開(kāi)可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類(lèi)雜質(zhì),在一定程度上有利于分離純化.為了獲得周質(zhì)蛋白 經(jīng)低濃度溶菌

15、酶處理后,可采用滲透壓休克的方法來(lái)獲得。,,可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。,⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇,應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。 先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類(lèi)雜質(zhì)）。,,隨后采用高分辨率的操作單元（

16、離子交換層析和親和層析）凝膠過(guò)濾放在最后，這樣可以提高分離效果。 層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過(guò)渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過(guò)濾。,⒊根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇,分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則： ⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 ⑵盡可能減少組成工藝的步驟 ⑶各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào),,⑷工藝過(guò)程中盡可能少用試劑