硒及富硒藻對(duì)萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)生殖及PHGPx基因表達(dá)的影響.pdf

1、生物餌料作為魚蝦類餌料，具有營養(yǎng)全面、分散性均勻、易于被消化且對(duì)水環(huán)境污染小等特點(diǎn)。相對(duì)于傳統(tǒng)的育苗模式，無論是從給予魚類苗種期營養(yǎng)角度還是從環(huán)境友好型漁業(yè)角度而言，生物餌料育苗模式表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)。但相對(duì)于天然生物餌料如枝角類、橈足類，人工培養(yǎng)的生物餌料尚存在營養(yǎng)物質(zhì)（如微量元素、維生素）不足而無法滿足魚類對(duì)營養(yǎng)的全面需求，因此生物餌料的營養(yǎng)強(qiáng)化問題在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上起著至關(guān)重要作用。本研究選取淡水養(yǎng)殖中最常用的蛋白核小球藻（Chlore

2、lla pyrenoidosa）和萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus）這兩種餌料生物作為研究對(duì)象，通過對(duì)小球藻和輪蟲的硒元素營養(yǎng)強(qiáng)化及其自身因硒的引入而引起生長變化等相關(guān)研究，探索既可以提高餌料的含硒量又能促進(jìn)生物餌料的生長發(fā)育的最適硒添加劑量，期望能達(dá)到提高生物餌料營養(yǎng)價(jià)值的目的，此外還通過測(cè)定輪蟲體內(nèi)磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)基因的mRNA表達(dá)量，深入認(rèn)識(shí)硒在機(jī)體內(nèi)的代謝過程，為未來的水產(chǎn)養(yǎng)殖行

3、業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:
　　1、無機(jī)硒對(duì)蛋白核小球藻生長及其生物富集的影響
　　將蛋白核小球藻分別以相同體積定量接入含不同濃度硒(0，10，20，40，60，80和100mg/L)的BBM培養(yǎng)基中，置于溫度為25℃、光照強(qiáng)度為20001x、晝夜比為L∶D=14∶10的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在第4d之前，對(duì)照組和各濃度實(shí)驗(yàn)組都處于緩慢生長階段，且增長速率差異不大，藻液顏色也都與初始狀態(tài)相似;從第4d之后則表現(xiàn)

4、出指數(shù)生長狀態(tài)，生長速率明顯上升，藻液顏色也隨之加深;直至第10d各實(shí)驗(yàn)組仍舊處于增長階段，但藻液顏色無顯著差異。第10d的處理組藻密度分別為（3.308±0.141）×106，（3.419±0.059）×106,(3.099±0.081)×106,(3.078±0.611)×106,(3.495±0.472)×106,（2.692±0.185）×106和（3.157±0.184）×106 cells/mL，各組之間都沒有顯著差異(P＞

5、0.05)。通過對(duì)比生長速率和平均世代時(shí)間進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn):不同硒濃度下小球藻的比生長速率分別為0.288±0.128，0.270±0.101，0.258±4.7e-3，0.262±0.154，0.294±9.6e-3，0.269±5.7e-3和0.273±7.1e-3d-1，平均世代時(shí)間分別為2.409±0.107,2.568±0.099,2.682±0.049,2.659±0.150,2.363±0.075,2.580±0.054和2

6、.547±0.066 d。研究結(jié)果表明:各處理組在上述兩個(gè)參數(shù)上都表現(xiàn)出一種上下波動(dòng)狀態(tài)，但在本實(shí)驗(yàn)的硒范圍內(nèi)，硒濃度的變化未引起小球藻明顯的生長差異。
　　對(duì)于小球藻對(duì)硒的富集能力研究發(fā)現(xiàn):在一定亞硒酸鈉范圍內(nèi)，小球藻對(duì)硒元素的生物富集效果隨著硒濃度的升高而增強(qiáng)。低濃度和高濃度硒(0-10mg/L和80-100mg/L)條件下，富硒速度較慢;硒濃度在10-80mg/L時(shí)，藻體富硒趨勢(shì)較快，此時(shí)小球藻對(duì)硒的生物富集能力較強(qiáng)。通過電

7、感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組含硒量分別為470.33±86.99，891.17±128.11，1231.82±126.67，1598.89±178.88，2065.13±19.95和2172.66±31.18mg/Kg，分別是非富硒組（357.24±29.11mg/Kg）的1.32，2.49，3.45，4.48，5.78和6.08倍。
　　2、硒及富硒藻對(duì)萼花臂尾輪蟲種群增長的影響
　　在25℃實(shí)驗(yàn)室培

8、養(yǎng)條件下，將萼花臂尾輪蟲暴露在不同濃度亞硒酸鈉溶液（0，0.05，0.1，0.2和0.4mg/L）的EPA培養(yǎng)基中，投喂密度為1×106cells/mL的未富集硒的蛋白核小球藻，研究其4d種群增長率變化。結(jié)果顯示:各處理組的種群增長率均高于對(duì)照組，隨著硒濃度的逐漸上升，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。亞硒酸鈉濃度為0.1，0.2，0.4mg/L時(shí)，其種群增長率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，與對(duì)照組相比，種群增長率r值分別上升了12.76％，

9、16.76％和14.22％。而0.05mg/L處理組與對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)，其r僅上升8.69％。
　　利用不同硒濃度（0，0.05，0.1，0.2和0.4mg/L）培養(yǎng)的蛋白核小球藻，得到含硒量不同的富硒小球藻。將密度為1×106cells/mL的富硒小球藻加入EPA培養(yǎng)液中進(jìn)行輪蟲培養(yǎng)。結(jié)果顯示:隨著硒濃度的增加，各處理組的種群增長率經(jīng)過下降、上升再下降的波動(dòng)，但總體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。方差分析結(jié)果表明:富硒小球藻對(duì)輪

10、蟲的4d種群增長具有顯著負(fù)面影響(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，各處理組的r值分別下降了36.94％，40.96％，17.63％和28.44％，其中0.05，0.1，0.4mg/L濃度組表現(xiàn)出明顯差異(P＜0.05)，而0.2mg/L實(shí)驗(yàn)組則與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。這表明:單純從種群增長率方面而言，富硒餌料微藻在短期內(nèi)不能增加輪蟲種群密度。
　　3、硒及富硒小球藻對(duì)萼花臂尾輪蟲磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx)基因

11、mRNA表達(dá)量的影響
　　在25℃實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，萼花臂尾輪蟲經(jīng)硒直接暴露處理（亞硒酸鈉溶液）和投喂富硒微藻處理（富硒小球藻），提取輪蟲RNA、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR研究硒對(duì)輪蟲PHGPx基因表達(dá)量的影響。直接暴露處理后，對(duì)輪蟲PHGPx基因的mRNA表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn):除0.05mg/L、0.1mg/L和0.4mg/L的12h處理組以及0.2mg/L和0.4mg/L處理組的36h，48h處理時(shí)間以外，其余各處理組萼花臂尾輪蟲的PH