26408.廈門近海溫泉微生物多樣性及熱穩(wěn)定纖維素酶的研究

1、福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文廈門近海溫泉微生物多樣性及熱穩(wěn)定纖維素酶的研究姓名：林白雪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：謝聯(lián)輝20100401摘要II群中，70℃和80℃溫泉中硫還原球菌目（Desulfurococcales）屬于優(yōu)勢(shì)類群。采用純培養(yǎng)的方法，從美國(guó)內(nèi)達(dá)華州溫泉和中國(guó)福建永泰溫泉分離得到100多株嗜熱細(xì)菌。從中篩選得到產(chǎn)纖維素酶和半纖維酶的嗜熱細(xì)菌并進(jìn)行了16SrDNA鑒定。LY7和LY8是產(chǎn)纖維素酶的嗜熱

2、細(xì)菌，菌株LY7屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillussp.)；菌株LY8屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillussp.)生長(zhǎng)范圍在40～70℃之間，最適溫度65C。LY1、LY2、LY3和LY4是產(chǎn)半纖維素酶的嗜熱菌，屬于土芽孢桿菌屬(Geobacillussp.)，生長(zhǎng)范圍在40～70C之間，最適溫度55C。在許多微生物降解纖維素過(guò)程中，β葡萄糖苷酶是限速酶，若β葡萄糖苷酶酶活低，會(huì)導(dǎo)致纖維二糖的累積從而抑制內(nèi)切葡聚

3、糖和外切葡聚糖酶活，影響整個(gè)纖維素降解進(jìn)程。為了大量獲得β葡萄糖苷酶并研究熱穩(wěn)定β葡萄糖苷酶的性質(zhì)，從溫泉嗜熱細(xì)菌Geobacillussp.LY8中克隆了熱穩(wěn)定的β葡萄糖苷酶基因。從氨基酸序列分析，該酶屬于糖苷水解酶類第一家族。將Geobacillussp.LY8的β葡萄糖苷酶基因與pGEX－4T2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建了重組菌，進(jìn)行了β葡萄糖苷酶的高效表達(dá)。重組β葡萄糖苷酶在大腸桿菌中以可溶的形式在細(xì)胞周質(zhì)大量表達(dá)。純化了重組β葡萄

4、糖苷酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。研究表明：（1）重組β葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)溫度的范圍非常廣泛：30－90℃均能發(fā)揮良好的酶活性，且在90℃仍有良好的酶活力。在55－75℃下處理120min，仍有很好的酶活力，有良好的溫度耐受性。說(shuō)明該重組β葡萄糖苷酶是一種優(yōu)良的高溫酶。（2）pH范圍廣：pH4pH8范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的酶活性。（3）具有很強(qiáng)的抗抑制劑和去污劑的能力。因此，該重組β葡萄糖苷酶是一種優(yōu)良的高溫酶，在中溫、

5、高溫（特別是高溫），以及酸性和中性pH條件下，均能發(fā)揮良好的酶活性，具有很大的應(yīng)用潛力。真菌是纖維素降解的主要微生物。本研究采用純培養(yǎng)的方法從溫泉中分離得到21株產(chǎn)纖維素酶的嗜熱真菌。對(duì)其中8株進(jìn)行18SrDNA鑒定，C1與WJM4WG屬于芽枝霉屬（Cladospiumsp.）。W3W、CC1、C2F1和C2F2屬于曲霉屬（Aspergillussp.）。CC8屬于毛孢酵母屬(Trichosponsp.)。WJM1G的ITS序列與已知序