25290.新一代高通量dna測(cè)序的新方法研究

1、東南大學(xué)博士學(xué)位論文新一代高通量DNA測(cè)序的新方法研究姓名：李燕強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程指導(dǎo)教師：陸祖宏20101103中文摘要利用該方法對(duì)一條固定在芯片中DNA序列進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果與原始序列一致，因此它可以應(yīng)用于固定有大量模板DNA芯片上，該方法具有通量高、測(cè)序能力強(qiáng)、成本低和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。2內(nèi)切酶V介導(dǎo)的連接測(cè)序方法基于連接反應(yīng)的測(cè)序(如SOLID系統(tǒng))是先把通用引物與待測(cè)DNA兩端的接頭序列互補(bǔ)結(jié)合；然后在連接酶的

2、介導(dǎo)下，將一個(gè)帶有熒光標(biāo)記8bp長(zhǎng)的核酸探針(fluorescemlylabeledoctamers)連接到引物3’末端；反應(yīng)完成之后，通過熒光圖像的分析即可鑒定出熒光標(biāo)簽所對(duì)應(yīng)的測(cè)定堿基；然后通過切斷第五堿基和第六堿基之間的連接，去掉熒光標(biāo)簽。如此反復(fù)，就可以獲得每間隔四個(gè)堿基的第五位堿基的確切信息。提出了使用不同長(zhǎng)度的引物(1或者1)或者在不同位點(diǎn)(比如第2位堿基)標(biāo)記熒光的8bp核酸探針片段來實(shí)現(xiàn)連接測(cè)序，以獲得整條模板片段的完整

3、序列信息。所提出的探針熒光切割方法不同在于：反應(yīng)中采用的切割反應(yīng)是在內(nèi)切酶V(也稱為脫氧次黃核苷3’內(nèi)切酶)的作用下進(jìn)行的。核酸內(nèi)切酶V是在Ecoli中發(fā)現(xiàn)的一種DNA修復(fù)酶。它識(shí)別DNA中的脫氧次黃核苷，即脫氧腺苷的去氨基產(chǎn)物。核酸內(nèi)切酶V可以在距錯(cuò)配脫氧次黃苷第二個(gè)或第三個(gè)磷酸二酯鍵的3’未端進(jìn)行切割，切割第二個(gè)磷酸二酯鍵的效率是95％，第三個(gè)磷酸二酯鍵的效率是5％，能夠產(chǎn)生一個(gè)3’羥基、5’磷酸的切口。利用該切口，進(jìn)行后續(xù)的雜交連

4、接反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)堿基的測(cè)定。通過引入硫代修飾的方法，來抑制次要切割位點(diǎn)，以達(dá)到唯一切割位點(diǎn)的目的。該方案已得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了25bp序列的正確讀取。3連接微測(cè)序方法在SNP分型上的應(yīng)用之前本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)提出一種通過雙色熒光雜交的方法在DNA芯片上檢測(cè)SNP，具有準(zhǔn)確性高且操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。但該方法的不足之處為每檢測(cè)一個(gè)位點(diǎn)就需要一對(duì)熒光標(biāo)記的探針。分析樣本數(shù)目不是很多時(shí)(如數(shù)百個(gè))，每個(gè)位點(diǎn)熒光探針的費(fèi)用平攤到每個(gè)樣本的成本就會(huì)