18020.洋甘菊fps基因的克隆表達及鹽脅迫研究

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特另tlDH以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：壘主至!至笙簽字日期：≯c綽己月歲Et學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學有

2、關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文，向社會公眾提供信息服務。(保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書)。學位論文作者簽名：皇恥簽字日期：枷12年‘月r日學位論文作者畢業(yè)后去向：速盟工作單位：盎毖延疃業(yè)盤墼電話：

3、!皇三蘭竺竺皇生2笪3通信地址：照例吐聳企鯉醒墨u&茲以步編：—羔■翌三塹————一㈣燁捅要洋甘菊(MatricariachamomillaL)又稱母菊，為菊科母菊屬一年生草本，含有揮發(fā)性芳香油，具有抑菌、消炎、解痙鎮(zhèn)靜、止痛及改善肺癌病人癥狀等作用，是一種極具開發(fā)價值的芳香植物和藥用植物。洋甘菊揮發(fā)油的主要成分為倍半萜類物質(zhì)，其生物合成途徑屬于類異戊二烯代謝途徑，而法呢基焦磷酸合酶(FPS)是這個途徑的限速酶之一。本文克隆了洋甘菊FP

4、S基因，構(gòu)建了FPS基因的原核表達載體，并在大腸桿菌中誘導表達，為通過基因工程有效調(diào)控母菊莫等倍半萜類物質(zhì)的生物合成奠定基礎(chǔ)。另本文對洋甘菊鹽脅迫后種子萌發(fā)特征，生理指標及顯微結(jié)構(gòu)進行了研究，為洋甘菊的進一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1克隆了洋甘菊FPS基因，并構(gòu)建克隆載體進行測序及生物信息學分析。根據(jù)洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全長序列(AccessionNo：EF6757581)，用軟件Primer

5、Premier5設計引物，以洋甘菊花。憩RNA為模板，通過RTPCR法獲得約1000bp大小的片段，并將其連接在pMD19T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，測序并進行生物信息學分析，結(jié)果表明：FPS基因全長為1098bo，開放閱讀框含有1032bp，編碼343個氨基酸殘基，與其它菊科植物的FPS基因進行同源性比較，對其疏水性，蛋白跨膜及信號肽分析表明洋甘菊FPS為非跨膜蛋白。2構(gòu)建了原核表達載體，誘導表達并優(yōu)化了目的蛋白表達條

6、件。將得到的洋甘菊FPS基因亞克隆到原核表達載體pET30a()，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a()FPS，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導表達目的蛋白，經(jīng)SDSPAGE檢測得到F1的蛋白分子量約為38KDa，并對日的蛋白進行Westernblotting檢測。對目的蛋白表達條件進行優(yōu)化，表明目的蛋白最佳誘導時問為6小時。3壩0定了不同鹽(Nacl)濃度脅迫下種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢、根長、莖長及生物量的變化，同時研究了葉綠

7、素含量，可溶性糖，過氧化物酶，脯氨酸的變化，并用石蠟切片法觀察了鹽脅迫前后洋甘菊根，莖，葉等的顯微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：隨著鹽濃度的升高，洋甘菊種子萌發(fā)率，發(fā)芽勢等萌發(fā)特征指標均呈下降趨勢，相對鹽害率增加，且隨著鹽濃度的升高，葉綠素含量先升高后降低，可溶性總糖、脯氨酸、過氧化物酶含量隨鹽濃度的升高呈上升趨勢。鹽脅迫前后洋甘菊外部形態(tài)發(fā)生明顯變化，顯微結(jié)構(gòu)中葉肉細胞層數(shù)明顯增加，鹽脅迫前后的莖和根氣隙增多，這些變化是對鹽環(huán)境的一種適應。關(guān)