111.基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺構建及應用研究

1、分類號UDC：密級華東理工大學學位論文基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺構建及應用研究譚俊指導教師姓名：儲炬教授華東理工大學申請學位級別：博士專業(yè)名稱：生物化工論文定稿日期：20121225論文答辯日期：20130220學位授予單位：蘭查望三丕芏學位授予日期：答辯委員會主席評閱人陳代杰朱春寶、張毅沈亞領、趙風生李柏林華東理工大學博士學位論文第1頁基于多尺度創(chuàng)新原理的工業(yè)微生物高通量篩選平臺構建及應用研究摘要菌種是發(fā)酵技術的源頭

2、，菌種發(fā)酵水平是決定企業(yè)產品能否參與市場競爭的技術保證，因此，微生物高通量篩選技術的研究和應用是提升工業(yè)發(fā)酵技術的必由之路。本論文通過流體動力學模擬深孔板與普通搖瓶的液體流動速度與剪切力分布，研究微型化培養(yǎng)過程中的氧傳遞、物料混合等科學問題，解決高耗氧微生物的微型化培養(yǎng)的關鍵技術。論文先以高耗氧絲狀真菌頂頭孢霉為研究對象，構建了靈活通用型菌株高通量篩選模型，再以好氧菌紅色糖多孢菌和紅曲霉為高通量分析及微型化培養(yǎng)對象，驗證了高通量篩選平臺

3、的準確與可行性，進一步推廣了高通量篩選技術的應用。首先以頂頭孢霉為研究對象，建立了提高篩選效率防止漏篩的高通量菌種篩選方法。即將所有誘變后孢子懸液等分至深孔板，同時培養(yǎng)與檢測，先篩選出具有高產特性的存在于孔板中某一深孔中的混合菌群，再進一步從中分離純化獲得高產菌株。所構建的高通量篩選方法提供給誘變株平等的篩選機會，有效克服了傳統篩選的漏篩問題。將此高通量篩選方法成功應用于頭孢菌素C(CPC)高產菌株篩選，成功獲得了一株頂頭孢霉高產菌株W

4、6，在50L發(fā)酵罐上CPC產量比出發(fā)菌株lD1提高了近2倍。接著開展了基于多尺度創(chuàng)新原理的菌種篩選后技術的系統研究，分別從代謝特性、菌形變化規(guī)律、酶學分析、與CPC合成相關的重要基因轉錄水平及定量代謝流分析等角度對獲得的高產菌株與出發(fā)菌株進行了系統分析比較，初步揭示了高產菌株的高產機理。其中，酶學水平上，比較了兩菌株在初級代謝過程中的四種關鍵酶酶活，分別是葡萄糖一6一磷酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。結果表明高產菌

5、株的異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶活性明顯提高，因此在補加豆油的情況下，乙醛酸循環(huán)途徑活性的明顯提高是導致CPC產量提高的重要原因。我們還對CPC合成途徑中的關鍵酶ACV合成酶、擴環(huán)酶／羥化酶、?；D移酶的編碼基因pcbAB，cefEF和ceil3進行了轉錄水平的比較。高產菌株W6的pcbAB、cefEF、celC在72h的mRNA轉錄水平分別是出發(fā)菌株(1D1)的5、8、12倍；在96h分別是1D1的5、14、15倍：在120h分別是1

6、D1的4、50、7倍。說明進入CPC合成期后cefEF轉錄差異最大，擴環(huán)酶／羥化酶的限制很可能是影響CPC合成增加的重要原因，從而為進一步基因改造或優(yōu)化培養(yǎng)條件提供了有益線索。代謝流計算結果表明，頂頭孢霉菌絲體內的碳主要是在以檸檬酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)和回補途徑進行代謝，高產菌株消耗的豆油總量較多，經過代謝分解成的C2底物濃度較高，導致其TCA循環(huán)通量較大。高產菌株W6進入乙醛酸循環(huán)途徑中的C2底物的通量是出發(fā)菌株的143倍，能夠生成更多的