miR-36f對(duì)豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的調(diào)控及其靶基因核酸疫苗免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、豬蛔蟲（Ascaris suum）在分類上屬于蛔蟲目(Ascaridida)，蛔蟲科(Ascarididae)，蛔蟲屬(Ascaris)，成蟲寄生于豬的小腸，是豬腸道中最大的寄生線蟲，呈世界性分布。就豬蛔蟲的危害而言，一方面，豬蛔蟲寄生消耗宿主營養(yǎng)，數(shù)量巨大時(shí)導(dǎo)致腸道堵塞；另一方面，豬蛔蟲幼蟲移行會(huì)對(duì)宿主器官造成機(jī)械性損傷。雖然化學(xué)藥物可以實(shí)現(xiàn)蛔蟲病治療，但由于長期對(duì)藥物的依賴以及不科學(xué)地使用，也造成了寄生蟲抗藥性的產(chǎn)生以及動(dòng)物產(chǎn)品藥物

2、殘留問題。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品健康的要求和關(guān)注度越來越高，開發(fā)新的、環(huán)境友好型、無殘留抗寄生蟲藥物越發(fā)顯重要。
　　MicroRNA（miRNA）是細(xì)胞內(nèi)一類非編碼小分子 RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在調(diào)節(jié)寄生蟲發(fā)育方面有著不可或缺的作用，提示我們可以從miRNA角度出發(fā)，尋找防控寄生蟲的新方法。DNA疫苗又稱裸DNA疫苗，是將具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表達(dá)載體，然后將此

3、重組的DNA通過注射等方式導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，在機(jī)體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白，使機(jī)體獲得免疫保護(hù)的一種新型疫苗。由于DNA疫苗不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，還能像減毒活疫苗一樣誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，并且其安全性良好，所以近年來越來越受到研究者的關(guān)注。
　　有鑒于此，本論文工作開展了以下兩方面的工作：
　　1.初步評(píng)價(jià)了asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲幼蟲發(fā)育及感染性的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)豬蛔蟲發(fā)育史miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)a

4、su-miR-36f只在豬蛔蟲的卵和幼蟲期特異表達(dá)，而在其他時(shí)期不表達(dá)，表明此miRNA在豬蛔蟲的早期發(fā)育可能有重要作用。因此，設(shè)計(jì)合成了 miRNA模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitor），并通過浸泡的方法來導(dǎo)入幼蟲體內(nèi)，檢測asu-miR-36f以及其兩個(gè)關(guān)鍵靶基因（OST48和Cyb）的表達(dá)量；然后將處理過的幼蟲感染小鼠并進(jìn)行了幼蟲回收和計(jì)數(shù)，初步探討其對(duì)豬蛔蟲幼蟲發(fā)育和感染性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：跟對(duì)照相比，抑制劑組回收

5、幼蟲的數(shù)量、長度和寬度差異顯著，可能是由于在抑制劑的作用下，asu-miR-36f在幼蟲體內(nèi)的水平下降，對(duì)某些靶基因的抑制作用減弱，從而對(duì)某些通路產(chǎn)生了影響，進(jìn)而對(duì)幼蟲的發(fā)育產(chǎn)生了影響。經(jīng)過模擬物處理實(shí)驗(yàn)組的回收幼蟲的數(shù)量、回收蟲體的長度和寬度與其他對(duì)照組相比差異不顯著，提示蟲體內(nèi)的miRNA功能的發(fā)揮可能依賴一定的閾值限制，當(dāng)miRNA的水平高于這個(gè)閾值的時(shí)候，隨著miRNA水平的升高，miRNA的功能不再明顯加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明通過

6、浸泡的方法可以有效地將miRNA導(dǎo)入到線蟲體內(nèi)。與基因槍、顯微注射等方法相比，此方法有簡單易行，對(duì)蟲體損傷小等優(yōu)點(diǎn)。
　　2.構(gòu)建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗，評(píng)價(jià)其免疫效果。
　　通過生物信息學(xué)分析，我們?cè)诒姸郺su-miR-36f的靶基因中選擇了兩個(gè)豬蛔蟲特有的靶基因。將這兩個(gè)靶基因，通過 PCR克隆、酶切、連接 pET30a質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化 DH5α、測序驗(yàn)證，并進(jìn)行BL21（DE3）原核表達(dá)后制備小鼠免疫多抗，

7、在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了pVAX1.0重組質(zhì)粒，并通過間接免疫熒光法、Western blot證實(shí)了構(gòu)建的兩個(gè)真核重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞表達(dá)，隨后進(jìn)行質(zhì)粒大量制備，通過注射方法免疫小鼠，檢測抗體水平、細(xì)胞因子水平、攻蟲實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)檢測了小鼠血清中IgG抗體及IgG1、IgG2a抗體亞類、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細(xì)胞含量、細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等，綜合評(píng)價(jià)了構(gòu)建的DNA疫苗的免疫保護(hù)性作用。結(jié)

8、果表明：pVAX-NCS可以有效地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，最終的減蟲率達(dá)35.96％；而pVAX-AG也可以引起實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是較弱，實(shí)驗(yàn)組的減蟲率也不及pVAX-NCS組。提示pVAX-NCS對(duì)小鼠具有較好的免疫保護(hù)作用。
　　綜上所述，本研究初步評(píng)價(jià)了 asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲幼蟲發(fā)育的影響，并利用其靶基因成功構(gòu)建了DNA疫苗，為豬蛔蟲DNA疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，因?yàn)?/p>