應(yīng)用單抗夾心ELISA檢測偽狂犬病毒和胸膜肺炎放線桿菌毒素ⅢA在巴斯德畢赤酵母中的表達及檢測方法研究.pdf

1、本論文包含2個部分。 1.檢測豬偽狂犬病毒單抗夾心ELISA方法的建立和應(yīng)用偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括家畜和多種野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為癥狀的重要傳染病。該病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，豬是本病毒的天然宿主和貯存者。準確、及時地檢測出病原是防止疾病擴散的重要措施之一。單克隆抗體的各種診斷方法在其它疾病的檢測中得到廣泛的應(yīng)用，顯

2、示出靈敏性高、特異性強等優(yōu)點。應(yīng)用單克隆抗體來檢測PrV在我國報道較少，為了能從感染PrV的動物體內(nèi)和肉食品中檢測出病原，本課題開展了以下研究。 1.1將豬偽狂犬病毒Ea株在IBRS-2細胞上增殖培養(yǎng)后，純化后免疫Balb/C小鼠，取其脾細胞與SP2/0的骨髓瘤細胞融合。經(jīng)ELISA篩選，獲得兩株分泌抗PrV單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞，分別命名為4A6F5和3G7E3。免疫熒光試驗和交叉試驗證明兩種單抗能特異性地與PrV反

3、應(yīng)，小鼠腹水中MAb的ELISA效價均為1：100×212。這兩株單克隆抗體為病毒抗原的診斷研究提供良好的材料。 1.2用純化的病毒免疫健康豬，制備了抗PrV血清，提純了IgG；將效價較高的一株單克隆抗體和抗血清IgG分別作為捕獲抗體和檢測抗體，用于建立檢測PrV的雙抗體夾心間接ELISA方法，并優(yōu)化了反應(yīng)條件，檢測結(jié)果顯示，該方法對PrV的檢測靈敏度達31.2ng(0.312μg/ml)，與乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸

4、障礙綜合癥(PRRSV)、細小病毒(PPV)和豬流感病毒(SIV)等病毒無交叉反應(yīng)。批間和批內(nèi)變異系數(shù)較小，介于為4.87％和1.07％之間。應(yīng)用本方法對人工感染PrV的40日齡仔豬組織進行檢測，肺和腦PrV抗原檢出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。應(yīng)用該方法和PCR對159份臨床病料進行平行檢測，二者的符合率可達到77.4％。實驗結(jié)果表明：雙抗體夾心間接ELISA方法具有敏感性高、特異性強和重復(fù)性好的特點，可應(yīng)用于發(fā)病動物組織中PrV檢

5、測。 1.3從武漢市及其周邊地區(qū)市場收集97頭份豬肉樣本、57頭份羊肉樣本、50頭份牛肉樣本，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法平行檢測樣本中的偽狂犬病毒。檢測結(jié)果顯示：97頭份豬肉樣中，雙抗體夾心ELISA方法PrV檢出19份(19.6％)，gD-PCR檢出25份(25.6％)；牛樣本中ELISA陽性數(shù)為0，PCR陽性2份(4％)；羊樣本中兩種方法均為陰性。這2種方法均為陽性和陰性的總份數(shù)為12和170份，

6、總符合率達到了89.2％，對部分ELISA陽性的樣本，病毒分離也為陽性。 2豬傳染性胸膜肺炎毒素Ⅲ在巴斯德畢赤酵母中的表達和應(yīng)用胸膜肺炎放線桿菌(Actinabacilluspleuropneumoniae，App)是豬傳染性胸膜肺炎(ProcineContagiouspleuropneumonic)的病原菌，毒素是決定其致病性的主要因素，其中ApxⅢ具有極強的細胞毒性，抗毒素抗體的檢測有助于疾病的檢測或評價用含滅活毒素成分疫苗

7、的免疫效果。重組蛋白的應(yīng)用，克服了天然蛋白純化的困難性，建立的檢測方法更具有特異性。與其它表達系統(tǒng)相比，酵母表達系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)點。為此，我們開展了ApxⅢ基因在畢赤巴斯德酵母中表達和應(yīng)用研究。 應(yīng)用PCR方法擴增豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)編碼毒素Ⅲ結(jié)構(gòu)蛋白的全長基因，連接到載體pMD-18-T中，酶切后連接到表達載體pPIC9k上，轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細胞，經(jīng)

8、甲醇誘導(dǎo)表達了分泌到胞外ApxⅢ蛋白。SDS-PAGE分析表明，表達的蛋白大小約為110kD，與預(yù)期相符。Dot-blot結(jié)果表明表達蛋白與豬抗APP血清有良好的反應(yīng)性。以表達產(chǎn)物為抗原包被微量反應(yīng)板，通過方陣滴定確定最佳抗原濃度(1：64)和血清稀釋度(1：40)，建立了檢測抗胸膜肺炎放線桿菌ApxⅢ抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(I-ELISA)方法。特異性實驗表明，該方法與副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌等分類相近細菌和其它病毒如豬偽狂犬病毒、