蛋白吸附層影響基因轉(zhuǎn)染的機(jī)理及硫鎓聚合物用于腫瘤基因輸送的研究.pdf

1、基因治療是將治療型核酸藥物輸送到細(xì)胞中特定靶點(diǎn)來更改基因表達(dá)的過程，因具備高療效低毒副作用的特點(diǎn)成為腫瘤等基因類疾病的理想治療方法?；蛑委煹呐R床應(yīng)用受制于缺乏安全、高效基因輸送載體。用于體內(nèi)基因治療的載體主要分為兩類:病毒載體和非病毒載體。病毒載體是工程化改造后的病毒，能介導(dǎo)攜帶的基因在靶細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)染并長期表達(dá)，因而成為基因治療臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最多的載體。但病毒載體存在生物安全性隱患和生產(chǎn)困難等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。非病毒載體，特

2、別是陽離子聚合物，具有低免疫原性和低毒性、通用性、容易擴(kuò)大制備等優(yōu)點(diǎn)。
　　然而，陽離子聚合物的主要缺陷之一是在血清存在下基因轉(zhuǎn)染效率會(huì)極大降低。以陽離子聚合物載體的金標(biāo)準(zhǔn)，分子量25 kDa的枝狀聚乙烯亞胺(bPEI25k)為例，其納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率會(huì)在血清存在下降低2-3個(gè)數(shù)量級。目前關(guān)于血清蛋白影響納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染的機(jī)理已有研究，但仍存在爭議且研究缺乏系統(tǒng)性。
　　因此，在第二章，我們以bPEI25k為模型載體，研究了

3、血清蛋白和牛血清白蛋白(BSA)對PEI納米復(fù)合物理化特性及對基因轉(zhuǎn)染的影響。血清蛋白或BSA吸附在PEI納米復(fù)合物表面，形成了穩(wěn)定的納米復(fù)合物/蛋白殼層結(jié)構(gòu)（將PEI/DNA及其納米復(fù)合物/蛋白殼層結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為復(fù)合物），對包括尺寸、表面電荷、形貌結(jié)構(gòu)和鹽離子敏感性等理化特性進(jìn)行了研究。以PEI/DNA/BSA質(zhì)量比為1/1/0(PEI/DNA)，1/1/4和1/1/40三種復(fù)合物為模型，進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)染過程和相應(yīng)機(jī)理。結(jié)果顯示，蛋白吸附

4、層決定了復(fù)合物的內(nèi)吞速率和途徑、進(jìn)入內(nèi)含/溶酶體速率、囊泡逃逸效率和基因表達(dá)水平。PEI/DNA和1/1/4通過非降解型內(nèi)吞途徑，即分別以包膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑和巨胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，從而表現(xiàn)出高基因轉(zhuǎn)染效率;1/1/40通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑快速進(jìn)入溶酶體中，由于無法從中逃逸被降解導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。
　　在第三章，我們進(jìn)一步研究了PEI/DNA和1/1/4兩種復(fù)合物在整體和單細(xì)胞水平上的基因表達(dá)。在整體細(xì)胞水平上，比較了兩種復(fù)合

5、物在不同孵育和轉(zhuǎn)染時(shí)間下基因表達(dá)速率的差異、DNA濃度對轉(zhuǎn)染水平（包括表達(dá)細(xì)胞百分比，表達(dá)水平）的影響及雙質(zhì)粒共表達(dá)的區(qū)別。在單細(xì)胞水平上，通過基于實(shí)時(shí)成像的單細(xì)胞分析技術(shù)，研究了細(xì)胞分裂對PEI/DNA和1/1/4兩種復(fù)合物基因表達(dá)的影響、細(xì)胞分裂結(jié)束到表達(dá)起始時(shí)間（啟動(dòng)時(shí)間）的分布和單細(xì)胞基因表達(dá)模式。通過觀察復(fù)合物的解離和入核，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物能穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞分裂時(shí)進(jìn)入細(xì)胞核后開始解離轉(zhuǎn)錄。這種DNA在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在，并隨

6、細(xì)胞分裂持續(xù)入核的特性是細(xì)胞能持續(xù)啟動(dòng)表達(dá)的原因。
　　與病毒載體相比，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染效率較低的主要原因是形成的納米復(fù)合物無法在細(xì)胞內(nèi)有效解離并快速釋放DNA。陽離子聚合物對基因轉(zhuǎn)染的影響較為復(fù)雜:盡管它能將DNA線團(tuán)包裹形成納米復(fù)合物，保護(hù)DNA免受核酸酶降解，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞，但它與DNA之間的強(qiáng)靜電相互作用導(dǎo)致納米復(fù)合物過于穩(wěn)定難以解離，從而無法快速釋放DNA。陽離子聚合物甚至?xí)cmRNA結(jié)合，干擾翻譯過程。
　　因此

7、，在第四章，我們設(shè)計(jì)了細(xì)胞內(nèi)降解去電荷型硫鎓聚合物用于基因輸送。與基于胺類的陽離子聚合物（例如bPEI25k）不同，該聚合物能在細(xì)胞內(nèi)降解成不帶電的片段，使得復(fù)合物解離并快速釋放出DNA，因而具備低細(xì)胞毒性和高表達(dá)效率。合成路線為先用“巰溴”點(diǎn)擊反應(yīng)制備含有苯硼酸/酯結(jié)構(gòu)的硫醚聚合物，再用強(qiáng)烷基化試劑三氯甲磺酸甲酯反應(yīng)定量得到硫鎓聚合物。通過改變單體投料比和化學(xué)結(jié)構(gòu)，成功制備并表征了七種具有不同分子量、親疏水性和活性氧自由基響應(yīng)能力的降

8、解去電荷型硫鎓聚合物。
　　在第五章，我們進(jìn)一步將該硫鎓聚合物用于腫瘤基因輸送，并研究了其ROS相關(guān)的轉(zhuǎn)染機(jī)理。形成的納米復(fù)合物通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后，能快速從內(nèi)含/溶酶體中逃逸。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高ROS濃度下，聚合物快速降解成電中性小分子片段，使得納米復(fù)合物有效解離并釋放DNA。我們闡明了聚合物結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)染效率之間的構(gòu)效關(guān)系。其中，硫鎓聚合物6CBE12k形成的納米復(fù)合物在有血清條件下轉(zhuǎn)染效率比bPEI25k高出2-3個(gè)