豬三十九肽膽囊收縮素（CCK39）的基因克隆、表達(dá)及其抗體的制備.pdf

1、揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文豬三十九肽膽囊收縮素（CCK39）的基因克隆、表達(dá)及其抗體的制備姓名：曹軍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：徐建生20050501豬三十九肽膽囊收縮素(CCK39)基因的克隆、表達(dá)及抗體的制備學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究生：曹軍導(dǎo)師：徐建生副教授中文摘要膽囊收縮素(Choleeystokinin，CCK)是一種廣泛分布在動物消化系統(tǒng)、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的腦腸肽，對動物胃腸道的作用主要是直接抑制胃酸分泌，抑制進(jìn)食

2、后的胃排空，并通過外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制胃運動。同時作為一種內(nèi)源性生理飽感信號，抑制攝食行為。近年來用膽囊收縮素對動物進(jìn)行免疫以提高采食量，增加生長速度取得了較好的效果。膽囊收縮素有多種分子形式，并具有種屬及器官的異質(zhì)性，在動物的胃腸道中主要以大分子形式存在，CCK39比較穩(wěn)定，常用于制備抗體。本研究的目的是運用基因工程技術(shù)大量制備膽囊收縮素重組蛋白，并以重組蛋白為抗原制備特異性抗體，為真正開發(fā)、運用膽囊收縮素調(diào)節(jié)動物采食量，提高生長速

3、度奠定基礎(chǔ)。為此，開展了如下的工作：1豬三十九肽膽囊收縮素(ccK39)基因的克隆和表達(dá)以豬十二指腸中提取的總RNA為模板，根據(jù)GenBank己發(fā)表的豬三十九肽膽囊收縮素(CCK39)基因序列設(shè)計一對特異性引物，并分別在上游引物引入BamHl酶切位點，下游引物引入EcoRI酶切位點。用RTPCR擴增CCK39基因的eDNA，測序、純化后用BamHI、EcoRI雙酶切，插入pGEX，6P，1質(zhì)粒獲得原核表達(dá)載體。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化產(chǎn)物

4、，用抗GST抗體Westenblot檢測融合蛋白。結(jié)果表明：成功地克隆出CCK39基因的eDNA，構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEXCCK39成功表達(dá)約32kD的融合蛋白。2抗三十九肽膽囊收縮素(ccK39)單克隆抗體的制備及初步鑒定以重組基因工程菌(pGEx—CCK39)表達(dá)并純化的融合蛋白GSTCCK39為抗原免疫BALB／c小鼠，同時用膽囊收縮素標(biāo)準(zhǔn)品CCK8檢測血清抗體。取免疫小鼠的脾絀胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞常規(guī)融合，進(jìn)行HAT選擇培