桑粒肩天牛幼蟲腸道優(yōu)勢菌群研究及Cry3A重組質(zhì)粒載體構(gòu)建.pdf

1、天牛是鞘翅目昆蟲中一個很大的類群，其幼蟲大多以木質(zhì)纖維為食。因為天牛危害，林木受害率達20-90％，每年經(jīng)濟損失上億元。而傳統(tǒng)的天牛防治方法費時、費工、成本又高，有的還對環(huán)境有嚴重污染。因此，探索新的防治途徑，開發(fā)新的防治技術(shù)，已成為生產(chǎn)上的迫切要求。新的害蟲防治方法和理論完善與發(fā)展離不開昆蟲生理生化的研究。近年來，研究昆蟲腸道正常菌群和腸道微生態(tài)以探索新的害蟲控制方法正在成為國內(nèi)外研究的熱點之一。 本文用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子

2、生物學(xué)方法－16S rRNA分析法對桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物組成進行了研究。同時本文還構(gòu)建了含有GFP標(biāo)記基因的Cry3A基因重組質(zhì)粒載體，并將此載體轉(zhuǎn)入桑粒肩天牛幼蟲腸道優(yōu)勢菌群，以期通過GFP標(biāo)記基因表達綠色熒光蛋白而研究優(yōu)勢菌群在桑粒肩天牛幼蟲腸道內(nèi)的定植以及Cry3A基因在桑粒肩天牛幼蟲腸道內(nèi)的表達。進而研究Cry3A表達的毒蛋白對天牛生長發(fā)育的影響，為新型轉(zhuǎn)基因生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。 主要研究結(jié)果如下：

3、 （1） 用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法共分離出28種細菌，經(jīng)鑒定為9個不同的屬，由分離率和腸道菌群的數(shù)量統(tǒng)計可得天牛腸道優(yōu)勢菌群是葡萄球菌屬（Staphylococcus），其菌量為7.84±0.61，分離率為100％；其次是腸桿菌屬（Enterobacter），其菌量為7.42±0.23，分離率也為100％。其它細菌分離率較低，依次是克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、變形桿菌屬（Proteus）

4、、沙雷氏菌屬（Serratia）、埃希氏菌屬（Escherichia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微球菌屬（Micrococcus）。 （2） 將傳統(tǒng)方法從桑粒肩天牛幼蟲腸道分離、鑒定的9個不同屬的細菌作為PCR模板，進行16S rRNA序列分析。研究結(jié)果表明這9個不同屬的細菌分別是葡萄球菌屬（Staphylococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、鏈球菌屬（Strept

5、ococcus）、變形桿菌屬（Proteus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、埃希氏菌屬（Escherichia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和微球菌屬（Micrococcus），與分離培養(yǎng)方法所獲得的結(jié)果一致。所測序列與BLAST中的16S rRNA序列相似性分別為98.78％、99.02％、98.86％、97.89％、99.24％、98.99％、98.44％、86.67％、99.18％（第一對引物）；99.23％、99.34％

6、、99.64％、98.35％、99.87％、99.08％、99.16％、99.32％、99.29％（第二對引物）。 （3） 用16S rRNA序列分析法研究結(jié)果表明桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物優(yōu)勢菌群為葡萄球菌屬（Staphylococcus），其次為腸桿菌屬（Enterobacter）。它們的16S rRNA基因序列與16S rRNA序列庫相似性分別為98.12％和99.04％。 （4） 成功構(gòu)建了含熒光蛋白GFP標(biāo)記基因