百合無癥病毒的RT-PCR和核酸雜交檢測及其外殼蛋白在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、　 百合無癥病毒是危害百合的重要病毒，在世界各地均有分布，是我國禁止進(jìn)境的潛在危險性有害植物病毒。該病毒病的發(fā)生日益嚴(yán)重，給百合種植業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前我國植物病毒檢驗檢疫工作和脫毒檢測的大量應(yīng)用還是在血清學(xué)檢測上，特別是ELISA檢測。但百合無癥病毒難以提純作為抗原，抗血清的生產(chǎn)沒有完全達(dá)到商品化，檢測基本依賴外國進(jìn)口試劑盒。分子生物學(xué)檢測方法靈敏度高，有很高的實際應(yīng)用價值。為此，本研究開展百合無癥病毒的分子生物學(xué)檢測方法及外殼

2、蛋白原核表達(dá)的研究，為其檢驗檢疫提供方法標(biāo)準(zhǔn)，并為抗血清的制備提供蛋白融合表達(dá)抗原材料。 對百合病株檢測表明，直接法，間接法，雙抗夾心法，斑點酶聯(lián)四種血清學(xué)檢測限度依次為：靈敏度320μg，160μg，80μg，160μg病葉。植株脫毒苗的檢出率分別為30﹪，35﹪，45﹪，55﹪。根據(jù)百合無癥病毒核酸序列設(shè)計一對特異性引物，對提取百合葉片中總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到412bp的目的片段，建立百合無癥病毒的RT-PCR檢測方法

3、。將此片段克隆到pUCm-T載體上，酶切后回收目的片段。用隨機(jī)引物法地高辛標(biāo)記合成cDNA探針，進(jìn)行核酸斑點雜交檢測。RT-PCR和核酸雜交檢測百合病葉總RNA的稀釋限度分別為1：10-6和1：10-2。檢測方法快速，靈敏。 應(yīng)用RT-PCR方法從感病百合總RNA中擴(kuò)增出百合無癥病毒的外殼蛋白基因片段，連接到原核載體pUC19，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE及Westernblot分析表明：外殼蛋白基因