單純皰疹病毒胸苷激酶與白介素2共表達(dá)真核載體的構(gòu)建及其在A549細(xì)胞中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含有自殺基因單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和人類細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)的聯(lián)合表達(dá)質(zhì)粒載體并觀察其在人類肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)，并探討其對(duì)A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。 方法：以真核表達(dá)質(zhì)粒pSNAV為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成多克隆位點(diǎn)（MCS），構(gòu)成中間質(zhì)粒pSNAV-MCS。通過(guò)酶切方法從其它質(zhì)粒載體中獲取不同片段HSV-TK、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以及IL-2，并依次插入MCS多克隆位點(diǎn)

2、中，得到重組質(zhì)粒pSNAV-TK-IRES-IL2(pMTII)。經(jīng)酶切、DNA測(cè)序鑒定正確后，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞(A549/pMTII細(xì)胞)TK和IL-2的基因mRNA轉(zhuǎn)錄；ELISA法檢測(cè)IL-2的分泌；光鏡觀察更昔洛韋(GCV)作用后A549/PMTII細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測(cè)GCV對(duì)A549/PMTII細(xì)胞的殺傷活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)GCV作用下A549/PMTII細(xì)

3、胞周期分布。 結(jié)果：經(jīng)酶切、DNA測(cè)序鑒定，雙基因真核表達(dá)載體pSNAV-TK-IRES-IL2序列正確。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后：RT-PCR法可檢測(cè)到TK和IL-2基因在該細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄；ELISA法可檢測(cè)到IL-2的分泌；光鏡下可觀察到GCV使用后自殺基因?qū)?xì)胞的殺傷效應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測(cè)表明GCV使用后，其細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯的抑制，且呈一定的濃度依賴效應(yīng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549/PMTII細(xì)胞經(jīng)GCV作用后，呈現(xiàn)明