短發(fā)夾RNA抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建HIF-1α基因RNA干擾慢病毒載體，觀察沉默HIF-1α基因后對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響。為進(jìn)一步研究腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制以及基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)選定HIF-1α基因RNAi靶序列，合成靶序列DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)XhoⅠ和HpaⅠ雙酶切后的慢病毒載體pLentilox3.7(pLL3.7)連接；產(chǎn)生的pLL3.7 HIF-1α慢病毒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌

2、DH5a，抽取質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定，然后進(jìn)行測序鑒定；(2)用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞(磷酸鈣轉(zhuǎn)染法)，包裝產(chǎn)生慢病毒，將收集的病毒上清經(jīng)高速離心濃縮后，按一定比例稀釋，然后感染293T細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測293T細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平，從而測定病毒滴度；(3)利用前期構(gòu)建的HIF-1α基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默HIF-1α基因，構(gòu)建HIF-1a-

3、shRNA的慢病毒表達(dá)載體，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87；(4)采用RT-PCR和Western blot檢測HIF-1α基因干擾效率，MTT法檢測細(xì)胞生長增殖，遷移實驗檢測細(xì)胞的體外遷移能力，Transwell小室模型檢測細(xì)胞的體外侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)果：(1)酶切和測序證實，構(gòu)建出HIF-1a-shRNA的慢病毒載體pLL3.7 HIF-1a;(2)包裝慢病毒，測得離心的濃縮病毒懸液的滴度為2×108TU

4、/ml；(3)RT-PCR證實HIF-1α-shRNA的慢病毒載體干擾U87細(xì)胞，細(xì)胞HIF-1α的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)；(4)Western blot檢測證實HIF-1a-shRNA的慢病毒載體干擾U87細(xì)胞，細(xì)胞HIF-1α的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)；(5)MTT比色法、Transwell小室侵襲實驗顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的實驗組與對照組相比，細(xì)胞增殖、侵襲能力受到明顯抑制差異顯著(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外成