常見細(xì)菌感染的芯片診斷系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、背景及目的:細(xì)菌感染是臨床的重要問題,早期診斷和治療具有重要的意義.延遲診斷導(dǎo)致盲目應(yīng)用抗生素,增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),促進(jìn)耐藥的發(fā)生.培養(yǎng)法是目前細(xì)菌感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但費(fèi)時長,且根據(jù)生化反應(yīng)等表征來診斷,易誤診.也不易作為監(jiān)測新發(fā)感染的工具.DNA芯片技術(shù),作為一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)可能成為細(xì)菌感染檢測的重要方法.目前的芯片雜交技術(shù)面臨的一些問題為結(jié)果重復(fù)性差,非特異性信號強(qiáng)及探針設(shè)計(jì)結(jié)果不可預(yù)測性,靶細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增后的標(biāo)準(zhǔn)菌株,而非

2、臨床菌株.采用的熒光顯色法需要昂貴的試驗(yàn)儀器,臨床不易推廣等.該文采用不對稱PCR,酶顯色等技術(shù)建立了一種檢測細(xì)菌感染的芯片系統(tǒng),不僅能夠快速靈敏的檢測靶細(xì)菌感染,而且重復(fù)性好,信號強(qiáng)及不易出現(xiàn)非特異信號,有可能在臨床得到廣泛應(yīng)用.方法:大腸埃希氏菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌,表面葡萄球菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽寡食單胞菌等的標(biāo)準(zhǔn)菌株由該院感染菌種保藏中心提供.取各菌株轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中,于35℃搖床過夜.以自

3、配的Chelex 100細(xì)菌DNA提取液抽取各菌種的DNA后于-20℃下保存.根據(jù)生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)以16S rRNA序列為靶基因設(shè)計(jì)各細(xì)菌的特異型探針和引物.待測細(xì)菌經(jīng)cy5標(biāo)記后的引物以不對稱PCR方法擴(kuò)增后,與固定探針的芯片進(jìn)行雜交.然后在熒光掃描儀掃描,判定細(xì)菌的種類.并與測序結(jié)果和培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較.以確定此方法的準(zhǔn)確性.同時也建立了芯片的酶顯色法,具有類似的敏感性.將其中一菌株系列稀釋后再雜交以測定芯片的敏感度.結(jié)果:建立了針