TGF-β1siRNA對(duì)膀胱腫瘤血管生成的影響.pdf

1、膀胱腫瘤是臨床上最常見(jiàn)的一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，而且也是一種威脅患者生命的疾病。膀胱癌的生物學(xué)行為特別復(fù)雜，主要變現(xiàn)為:復(fù)發(fā)、多發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等。90％的膀胱癌是尿路上皮癌，且具有高復(fù)發(fā)性率。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)機(jī)制目前尚不明了，近年來(lái)隨著相關(guān)研究的深入，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factorsβ1，TGF-β1)能促進(jìn)腫瘤血管的生成從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。
　　目的:探討通過(guò)選擇人工設(shè)計(jì)合成抑

2、制作用最佳的TGF-β1siRNA轉(zhuǎn)染入人膀胱癌細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)明確TGF-β1siRNA對(duì)膀胱腫瘤血管生成的影響。
　　方法:將膀胱癌細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌細(xì)胞分為常規(guī)細(xì)胞組、脂質(zhì)體組（陰性對(duì)照組）和3組（A組、B組和C組）含不同TGF-β1siRNA表達(dá)載體組。選擇人工設(shè)計(jì)合成好的三種TGF-β1siRNA，通過(guò)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入A組、B組和C組后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-t

3、ime PCR)與雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)共同檢測(cè)轉(zhuǎn)染TGF-β1siRNA的人膀胱癌細(xì)胞株TGF-β1的表達(dá)，選出最佳抑制組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將膀胱癌細(xì)胞分為EJ腫瘤細(xì)胞組、對(duì)照組（TGF-β1組）、重組質(zhì)粒組（TGF-β1siRNA表達(dá)載體組）。對(duì)照組采用10ng/ml TGF-β1刺激，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)該組與正常EJ細(xì)胞組、TGF-β1組、

4、重組質(zhì)粒組中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:人膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)良好，TGF-β1siRNA轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與常規(guī)培養(yǎng)的EJ細(xì)胞組比較，TGF-β1mRNA在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的EJ細(xì)胞組內(nèi)的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒對(duì)TGF-β1mRNA的表達(dá)無(wú)明顯干擾;與常規(guī)細(xì)胞組和空白質(zhì)粒組比較，TGF-β1mRNA在三個(gè)不同TGF-β1SiRNA組 EJ細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均有顯著下降(P＜

5、0.05)，其中C組最顯著(P＜0.01)，表明所設(shè)計(jì)的三種TGF-β1SiRNA對(duì)TGF-β1mRNA的表達(dá)均具有抑制作用，其中C組TGF-β1SiRNA序列與其他序列比較具有最佳抑制效果。Elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與常規(guī)培養(yǎng)的EJ細(xì)胞組比較，TGF-β1蛋白在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的EJ細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒對(duì)TGF-β1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯干擾，與RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果一致;與常規(guī)細(xì)胞組和空白質(zhì)粒組比較，TGF-

6、β1蛋白在三個(gè)不同TGF-β1SiRNA組EJ細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均有顯著下降(P＜0.05)，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，TGF-β1蛋白的Elisa檢測(cè)也印證了所設(shè)計(jì)的三種TGF-β1SiRNA對(duì)TGF-β1的表達(dá)均具有抑制作用。使用Western Blot檢測(cè)各組VEGF蛋白的表達(dá):與正常EJ細(xì)胞組比較，VEGF蛋白在轉(zhuǎn)染TGF-β1質(zhì)粒的EJ細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增大(P＜0.05)，表明VEGF蛋白的表達(dá)與TGF-β1呈正相關(guān);與正常EJ細(xì)