利用克隆羊進行各類神經(jīng)干細胞移植治療腦挫裂傷的研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)組織的再生是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一,神經(jīng)干細胞(NeuralStemCell,NSC)移植治療是目前一種新興的,具有良好應(yīng)用前景的治療方法,在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的許多疾病當中已經(jīng)有很多研究證實了其移植治療的有效性。腦外傷是神經(jīng)外科臨床工作中最常見的一大類疾病,危害極大,治療價值最高。雖然不同種類的腦外傷有各自不同的病理生理過程,但有相當一部分的腦外傷都伴有或輕或重的腦挫裂傷,故本實驗就專門針對腦挫裂傷進行研究。NSC依據(jù)其來源分

2、為胚胎源性神經(jīng)干細胞(embryonic-derivedneuralstemcells,EdNSC)和成體源性神經(jīng)干細胞(adultderivedneuralstemcells,AdNSC)兩大類。這兩類神經(jīng)干細胞細胞移植治療腦挫裂傷時哪個效果更好?不同來源的各類神經(jīng)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時是否發(fā)生免疫排斥反應(yīng)?能否建立一種可控性、重復(fù)性好,觀察指標明確、操作簡單確實可靠的大動物腦挫裂傷模型?對于這些問題,目前尚無系統(tǒng)性的研究。

3、本實驗充分利用了克隆羊這一遺傳背景清楚的大動物作為模型,同時利用克隆技術(shù)得到來源相同的“自體”EdNSC和AdNSC及異體AdNSC,來解決上述問題。本實驗的第一部分首先對成體克隆羊(編號:CL-4)及成體非克隆羊(編號:SP-3119)通過開顱手術(shù)的方法取得其皮層腦組織,進而在體外培養(yǎng)獲得克隆羊及非克隆羊的AdNSC;然后對CL-4克隆羊通過體細胞核移植(somaticcellnucleartransfer,SCNT)技術(shù)獲得其克隆胚

4、胎羊(此步驟由本課題的合作單位完成),當胚胎羊在“代理母親”體內(nèi)長至35天時,采用外科手術(shù)獲取其腦組織,繼而在體外培養(yǎng)得到EdNSC。這樣對于與CL-4同一批次的克隆羊來說,所得到的EdNSC及克隆羊的AdNSC排除表觀遺傳學(xué)因素,可認為是“自體NSC”;而非克隆羊的AdNSC是“異體NSC”。我們對所得到的這三類NSC通過Nestin鑒定后,用綠色熒光蛋白(GFP)進行標記以用作移植治療。另外在NSC培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)EdNSC體外培養(yǎng)速

5、度比AdNSC快。在本實驗的第二部分中,我們隨機選取與CL-4同一批次的CL系列克隆羊20只。通過外科手術(shù)開顱暴露出克隆羊大腦上薛氏溝周圍的運動皮層區(qū),然后使用50g×100cm力度作自由落體加速撞擊,建立起觀察指標明確的克隆羊腦挫裂傷模型。第三部分中,我們將已建立模型的動物隨機分成四組,分別用第一部分所得到的三類NSC:克隆羊的EdNSC、AdNSC和非克隆羊的AdNSC以及生理鹽水進行移植治療。觀察比較移植治療后各組動物的存活率;行

6、為學(xué)恢復(fù)情況;腦損傷對側(cè)肢體運動功能恢復(fù)情況及運動誘發(fā)電位的恢復(fù)情況;并測定各組動物頭顱MRI影像學(xué)及病理顯微觀的改變;同時比較移植到腦內(nèi)的各類神經(jīng)干細胞在動物腦內(nèi)的存活、遷移、分化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):克隆羊EdNSC、AdNSC移植組與非克隆羊AdNSC移植組及對照組相比,動物的存活率、行為學(xué)恢復(fù)情況及腦損傷灶對側(cè)肢體運動功能恢復(fù)情況及運動誘發(fā)電位的恢復(fù)情況明顯提高;頭顱MRI影像學(xué)及損傷區(qū)域病理顯微觀表現(xiàn)明顯改善;移植到腦內(nèi)的神經(jīng)干細胞

7、均可良好存活、遷移、分化;這兩組比較而言,EdNSC的移植治療效果相對更好一些,表現(xiàn)在腦損傷灶對側(cè)肢體運動功能恢復(fù)更快;影像學(xué)及病理顯微觀顯示腦挫裂傷灶吸收、恢復(fù)更快。而非克隆羊AdNSC移植組與對照組相比,移植治療效果差別不大。在實驗的第四部分中,我們專門對各類NSC移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的免疫排斥反應(yīng)問題進行了研究。實驗中我們檢測了細胞移植前后不同時間點(造模前1天、細胞移植前、細胞移植后3天、1個月及3個月時)各組動物血液中細

8、胞因子(IL-2,IL-6,IL-10)水平,以及細胞移植后急性期(細胞移植后1周)和慢性期(細胞移植后3個月),移植局部病理切片中CD3+細胞浸潤的免疫組化染色情況,力爭從全身和移植局部兩個方面探討各類神經(jīng)干細胞移植后免疫排斥反應(yīng)這一問題。結(jié)果發(fā)現(xiàn):非克隆羊AdNSC組移植后3天、1個月、3個月時IL-2水平較其它組明顯升高(P<0.05);細胞移植3個月時該組動物血中IL-6水平較其它組明顯升高(P<0.05);而在移植后3天、1個

9、月、3個月時該組動物血中IL-10水平較其它組明顯下降(P<0.05)。而克隆羊EdNSC及AdNSC移植組之間及它們與對照組相比,各時間點動物血液中細胞因子(IL-2,IL-6,IL-10)水平均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。非克隆羊AdNSC(異體細胞移植組)在細胞移植后的急性期(移植后1周)和慢性期(移植后3個月),移植局部CD3+細胞的數(shù)量明顯比其它組多【與其它組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)】,說明該組移植部位發(fā)生了免疫排

10、斥反應(yīng)。而兩個“自體”細胞移植組(克隆羊EdNSC和AdNSC移植組),移植局部CD3+細胞的數(shù)量與對照組相比無明顯的增多,這說明這兩個“自體”神經(jīng)干細胞移植組局部未發(fā)生明顯免疫排斥反應(yīng)。這兩個“自體”細胞移植組之間相比,可以看到EdNSC組CD3+細胞的數(shù)量稍多,但二者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。綜上,通過本實驗我們得出了以下結(jié)論:1.對胚胎克隆羊、成體克隆及非克隆羊通過外科手術(shù)取其皮層腦組織,在體外培養(yǎng)均能得到生長良好的胚胎

11、神經(jīng)干細胞(EdNSC)及成體神經(jīng)干細胞(AdNSC)。在相同的條件下,EdNSC體外培養(yǎng)速度比成AdNSC快。2.對羊腦上薛氏溝周圍運動皮層區(qū)使用50g×100cm力度作自由落體加速撞擊,可產(chǎn)生觀察指標明確且存活率高的羊腦挫裂傷模型,有望廣泛用于神經(jīng)干細胞移植及藥物等治療的實驗研究。3胚胎神經(jīng)干細胞(EdNSC)及成體神經(jīng)干細胞(AdNSC)移植治療腦挫裂傷后均有較明顯的治療效果;二者相比較而言胚胎神經(jīng)干細胞(EdNSC)稍好于成體神