RNA干擾STUB1基因?qū)θ司铙w上皮細(xì)胞增殖及分子伴侶表達(dá)的影響.pdf

1、蛋白質(zhì)變性沉積是白內(nèi)障發(fā)生的重要的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)。分子伴侶和泛素-蛋白酶體(UPP)通路是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的核心機(jī)制。分子伴侶，主要由熱休克蛋白組成，對(duì)細(xì)胞內(nèi)變性蛋白質(zhì)進(jìn)行重新折疊和修復(fù)；UPP通路則將修復(fù)失敗的有害蛋白質(zhì)降解清除。二者相輔相成，共同降低細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)的濃度，維持細(xì)胞的正常生理功能。年齡相關(guān)性白內(nèi)障和其他年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生都與二者的功能下降密切相關(guān)。
　　 STUB1蛋白(又稱CHIP蛋白)是一種同時(shí)

2、具有E3泛素連接酶活性和輔助分子伴侶活性的胞漿蛋白，它將分子伴侶和UPP通路兩條蛋白質(zhì)質(zhì)量控制途徑聯(lián)系起來，對(duì)變性/有害蛋白質(zhì)的命運(yùn)起著關(guān)鍵的決定作用。STUB1是一種氨基酸序列高度保守的胞漿蛋白，在心肌、骨骼肌和腦等高代謝組織中高表達(dá)，在晶狀體中也有表達(dá)。很多研究已證實(shí)STUB1蛋白與多種神經(jīng)變性疾病及蛋白質(zhì)沉積疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。但目前對(duì)STUB1蛋白在晶狀體內(nèi)作用的研究很少。
　　 為了探討STUB1蛋白在人晶狀體上皮細(xì)

3、胞(HLEC)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中的作用，以及這些蛋白質(zhì)間的相互作用，從而為研究白內(nèi)障發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們構(gòu)建了針對(duì)人STUB1基因的ShRNA干擾慢病毒載體，觀察干擾STUB1基因后HLEC生長(zhǎng)狀態(tài)的變化及分子伴侶HSP70、HSP90及HSP27的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。進(jìn)一步探討其相互作用的具體機(jī)制。
　　 目的：明確RNA干擾STUB1基因?qū)θ司铙w上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響及對(duì)分子伴侶HSP70、HSP90、HSP

4、27表達(dá)的影響，探討STUB1在白內(nèi)障防治中的重要作用。
　　 方法：構(gòu)建1個(gè)針對(duì)STUB1基因的表達(dá)質(zhì)粒和3個(gè)不同靶序列的干擾質(zhì)粒(KD1，KD2，KD3)，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36h后收集細(xì)胞總蛋白質(zhì)樣本，Westernblot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組STUB1蛋白的表達(dá)變化，篩選出具有最高干擾效率的靶序列，包裝成慢病毒載體；按不同的轉(zhuǎn)染條件，用陰性對(duì)照慢病毒預(yù)轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞系SRA01/04株(HLEC)，轉(zhuǎn)染后第4天激光共聚焦

5、生物顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確定最佳轉(zhuǎn)染條件；設(shè)定實(shí)驗(yàn)分組：RNA干擾組，陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組。按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳轉(zhuǎn)染條件將干擾慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染HLEC，倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后第1、5、10、15及20天細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT比色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后第1-6天及第10、15天各組間細(xì)胞生長(zhǎng)活性的變化；收集轉(zhuǎn)染后第5、10天的各組總RNA樣本，Real-TimePCR檢測(cè)各組的STUB1及分子伴侶HSP90，HSP70，HSP27的mRNA

6、水平的變化；收集轉(zhuǎn)染后第5、10、15、20天的各組總蛋白樣本，WesternBlot檢測(cè)各組的STUB1及分子伴侶HSP90，HSP70，HSP27的蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04株)，并可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)其攜帶的外源性基因，KD1序列具有最佳干擾效率；轉(zhuǎn)染后第1、5天各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，第10天RNA干擾組及陰性對(duì)照組的HLEC變成梭狀，呈現(xiàn)纖維老化變形，以RNA

7、干擾組為甚。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞變形現(xiàn)象明顯。MTT結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后第1-3天RNA干擾組的HLEC生長(zhǎng)活性較陰性對(duì)照組有下降趨勢(shì)，第4-5天生長(zhǎng)活性趨于穩(wěn)定，而第6-15天HLEC生長(zhǎng)活性受到抑制，但隨時(shí)間推移細(xì)胞的生長(zhǎng)活性逐漸恢復(fù)。Real-TimePCR結(jié)果顯示：RNA干擾STUB1基因后第5天，STUB1和HSP70的mRNA水平分別較陰性對(duì)照組下降了5.12倍和4.24倍，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RNA干擾后第10天，STUB1的mR

8、NA水平較陰性對(duì)照組下降了5.88倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HSP70、HSP27和HSP90均無明顯下降，甚至較陰性對(duì)照組有所增加。WesternBlot結(jié)果顯示：STUB1在干擾后第5、10、15、20天蛋白含量明顯減少；HSP70第5、10天蛋白水平均減少；HSP27第5、15天蛋白水平下降，而第10、20天無明顯變化；HSP90在第10天減少，第5、15、20天無明顯變化。
　　 結(jié)論：RNA干擾HLEC的STUB1基因可引起