蛇根木阿嗎靈生物合成途徑中三個(gè)重要酶的表達(dá),純化,結(jié)晶,三維結(jié)構(gòu)表征及催化機(jī)理研究.pdf

1、蛇根木(Rauvolfia serpentina Benth.ex Kurz)為夾竹桃科蘿芙木屬藥用植物,富含生物堿類(lèi)化合物,其主要活性成分為阿嗎靈、阿嗎堿和利血平,有降血壓、抗心律失常、退熱、抗癲、治蟲(chóng)蛇咬傷等功效。對(duì)其次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑的研究是進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該藥用植物、調(diào)控生物代謝方向、體外異源表達(dá)活性成分的基礎(chǔ)。本論文對(duì)參與蛇根木生物堿阿嗎靈生物合成途徑的聚精液素醛酯酶(PNAE) Vinorine合成酶(VS)和異胡豆苷合

2、成酶(STR1)進(jìn)行了一系列的研究,主要包括酶的表達(dá)、純化、結(jié)晶、三維結(jié)構(gòu)表征及催化機(jī)理研究。為進(jìn)一步深入研究PNAE酶的三維結(jié)構(gòu),活性位點(diǎn)構(gòu)造及催化機(jī)理,本論文對(duì)PNAE酶的突變體及突變體與底物的復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)晶條件的摸索,采用氣相擴(kuò)散懸滴法進(jìn)行結(jié)晶,底物浸泡法獲取PNAE突變體與產(chǎn)物的復(fù)合物,對(duì)所搜集衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,獲得了酶與產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu),闡明了該酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)及其催化機(jī)理,為合理進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。VS酶的三維

3、結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明,但其活性位點(diǎn)及催化機(jī)理尚不確定,因此對(duì)VS酶與底物或輔因子復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的解析顯得尤為重要。本論文嘗試了各種獲得復(fù)合物的方法,并搜集了衍射數(shù)據(jù),經(jīng)初步處理并未發(fā)現(xiàn)配體出現(xiàn)在酶分子中。由于STR1高效表達(dá)過(guò)程中產(chǎn)生大量的包涵體,獲得的可溶性蛋白量很低,為進(jìn)一步利用該酶帶來(lái)了很大的不便。本論文對(duì)原有表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)并構(gòu)建了新的表達(dá)系統(tǒng),對(duì)不同的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)量篩選及活性比較,確定改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量為原有表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量