EphA2及E-cadherin基因表達(dá)與食管癌發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系的研究.pdf

1、背景和目的；樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是一類專業(yè)的抗原遞呈細(xì)胞，在體內(nèi)具有強(qiáng)大的激發(fā)初次免疫和再次免疫的能力。已有研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞除了通過細(xì)胞間直接接觸和分泌細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的作用方式之外，還可通過分泌具有抗原遞呈能力的囊泡狀小體exosomes來誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)。Exosome是直徑為30nm-100nm的囊泡狀小體，許多細(xì)胞都具有分泌exosome的能力，例如肥大細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、血小板、

2、腫瘤細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等。Exosome內(nèi)部富含MHCⅠ和MHCⅡ類復(fù)合體、T淋巴細(xì)胞共刺激分子等。 有報道稱腫瘤抗原肽沖擊的樹突狀細(xì)胞分泌的exosomes可在小鼠體內(nèi)特異性的激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，抑制腫瘤的生長，甚至能徹底消滅小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。以exosomes為基礎(chǔ)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的腫瘤疫苗提供了一種可以替代樹突狀細(xì)胞的腫瘤生物治療模式。 在體外，用腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞能夠激發(fā)出強(qiáng)大的、T淋巴細(xì)胞

3、介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本實驗提取人胃腺癌BGC-823細(xì)胞和人白血病K562細(xì)胞總RNA，轉(zhuǎn)染人臍血來源的樹突狀細(xì)胞后，提取樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的exosomes，觀察其能否誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤效應(yīng)。 方法；1臍血來源DC體外誘導(dǎo)擴(kuò)增采用四步梯度離心法從臍血中分離單個核細(xì)胞(MNC)后，以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，2h后貼壁細(xì)胞為單核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子rhGM-CSF(50ng/ml)，rhIL-4(10ng/ml

4、)誘導(dǎo)分化。2T細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)方法1中非貼壁細(xì)胞用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加入rhIL-2(5ng/ml)。 3總RNA制備及鑒定參照RNA提取試劑Trizol說明書將處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞和K562細(xì)胞抽提總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，紫外分光光度儀測定A260/A280數(shù)值。 4總RNA轉(zhuǎn)染DC參照陽離子脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000試劑說明書，用腫瘤細(xì)胞總

5、RNA轉(zhuǎn)染DC。 5轉(zhuǎn)染后DC行透射電鏡分析。 6轉(zhuǎn)染前后DC表面標(biāo)志變化取轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)5d未成熟DC及培養(yǎng)第8d分別轉(zhuǎn)染兩種腫瘤細(xì)胞總RNA后DC，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測DC表面標(biāo)志性標(biāo)志物CD54、CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)水平。 7四步離心法提取exosomes。8exosomes的透射電鏡分析滴20-30μlexosomes懸液于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1h，用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20ml/L

6、磷鎢酸溶液約30μl于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1min，濾紙吸干負(fù)染液，白熾燈下烤干約10min,透射電鏡下觀察照相。 9MTT法檢測exosomes激活的CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性exosomes激活的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效靶比分別為10∶1和20∶1。并設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對照組和靶細(xì)胞對照組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。殺傷活性=[靶細(xì)胞對照組A值-(實驗組A值-效應(yīng)對照組A值)]/靶細(xì)胞對照組A值×100％。 10采用S

7、PSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所獲數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用配對t檢驗。 結(jié)果；1培養(yǎng)8d后，通過光鏡和透射電鏡觀察可見典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。 2通過紫外分光光度計測得OD260/280=1.87，證明提取的RNA較為純凈。經(jīng)RNA電泳，呈現(xiàn)5S，18S，28S3條完整條帶而無其他雜帶干擾，也無拖尾現(xiàn)象，證明RNA未降解。 3DC轉(zhuǎn)染后72h，在CD54、CD80、CD86、HLA-DR等成熟標(biāo)志的

8、表達(dá)上均有顯著升高。 4MTT法檢測exosomes激活的CTL和未經(jīng)exosomes激活的CTL對BGC-823細(xì)胞和K562細(xì)胞的殺傷率，激活組殺傷率明顯高于未激活組，證明RNA轉(zhuǎn)染DC泌exosomes具有強(qiáng)大的激活CTL的能力。 結(jié)論；通過本實驗的研究，可得出如下結(jié)論：轉(zhuǎn)染了腫瘤細(xì)胞總RNA的DC分泌的exosomes具有強(qiáng)大的激活CTL的能力，經(jīng)實驗證明，激活的CTL在體外對腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷活性，無論是實體